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采用毒死蜱生产工厂排污口的污泥为研究材料,将污泥按10%的接种量接入无机盐培养基,每7d添加一次毒死蜱,并添加无机盐培养基至体积保持恒定,富集培养。将毒死蜱乳油添加到固体培养基中制备成毒死蜱选择性平板,利用毒死蜱选择性平板从污泥中筛选获得降解菌株,依据在选择性平板水解圈的形成,在7d和35d分别筛选获得菌株G1和X1。研究了这两株降解菌的降解特性,菌株G1和X1都能够高效地降解毒死蜱。在pH值为5-9,温度为22-42℃的条件下,菌株X1和菌株G1都能够有效地降解毒死蜱；pH值和温度的变化影响菌株对毒死蜱的降解,在pH7和42℃条件下菌株降解毒死蜱更快；虽然42℃并不是这两株菌的最适生长温度,但在此温度条件下菌株的降解能力很高。将培养好的菌液按照10%的接种量接入含有毒死蜱的液体无机盐培养基,在37℃、120r/min条件下培养,评价菌株对毒死蜱的降解能力；利用二氯甲烷提取试管中残留的毒死蜱和产生的中间代谢产物3,5,6-三氯-2-吡啶(TCP),研究降解菌对毒死蜱降解的代谢途径,结果显示这两株菌都是将毒死蜱转化为TCP；菌株X1可以在24h内完全降解100mg/1的毒死蜱,即降解毒死蜱及其中间代谢产物TCP,整个降解过程中毒死蜱浓度逐渐下降,而TCP浓度先上升后下降。菌株G1能将毒死蜱转化为TCP,但不能进一步降解TCP。在降解过程中菌株X1和G1细胞浓度都未出现明显的变化。研究了菌株X1对高浓度毒死蜱的降解能力,结果显示在48h内,菌株能够完全降解200-400mg/l的毒死蜱；当试管中毒死蜱浓度为500mg/1时,菌株X1能降解98.4%的毒死蜱；当浓度达到600mg/1的毒死蜱,48h时菌株X1只能降解73.3%的毒死蜱。革兰氏染色结果显示,菌株X1和菌株G1都是革兰氏阴性细菌。利用细菌16SrDNA基因通用引物扩增菌株的16S rDNA基因,将获得的基因序列与典型菌株的16S rDNA基因比对,结果显示：菌株X1与台湾嗜铜菌(Cupriavidus taiwanensis) LMG19424(AF300324)相似性最高,达到98%；菌株G1与微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila) AMX19(AF273080)具有最高的同源性,达到99%。结合菌株的部分生理生化特性,菌株X1被鉴定为台湾嗜铜菌,而菌株G1被鉴定为微嗜酸寡养单胞菌。利用限制性内切酶Sau3AI随机酶切基因组DNA,将获得的基因组片段与质粒pUC19连接并转化至大肠杆菌中,分别构建菌株G1和菌株X1的基因组文库,在含有农药和抗生素的平板上,分别获得了能够产生水解圈的单克隆。测序结果显示,从菌株X1中获得了一个3217bp的DNA片段,从菌株G1中获得了长4018bp的DNA片段。软件分析这两个DNA片段,结果显示这两个DNA片段都具有多个开放阅读框。将这些阅读框的序列分别提交至NCBI上比对,菌株X中的毒死蜱降解酶基因与有机磷水解酶(ophB)基因相似度高达99%,判断菌株X1能够降解毒死蜱是该基因编码的酶起作用,这是首次发现ophB基因存在于嗜铜菌中并编码毒死蜱降解酶基因；而菌株G1中的毒死蜱降解酶基因与甲基对硫磷降解酶(mpd)基因具有高度同源性,推断mpd基因编码菌株G1的毒死蜱降解酶。分别克隆mpd基因和oph基因,将这两个基因片段插入到原核表达质粒pET28a,构建大肠杆菌表达质粒pETmpd和pEToph。质粒分别被转化到大肠杆菌中诱导表达,其中mpd基因诱导3h表达量最高,SDS-PSGE显示一个大小约30kDa的蛋白被诱导表达,此时大肠杆菌细胞破碎液的酶活(μg毒死蜱/μg蛋白·h)为0.279士0.001,菌株G1的粗提液对毒死蜱的催化活性为0.025土0.002；而oph基因在大肠杆菌中诱导后,通过SDS-PAGE没有观察到明显的特异性蛋白条带,但是细胞破碎液的毒死蜱降解活性为0.035士0.002,菌株X1细胞粗提液的毒死蜱水解活性为0.018士0.001。玫瑰红红球菌是革兰氏阳性菌,该菌能够转化和降解多种环境污染物,烷烃类有机物,也被用于生物脱硫以及有机物的脱氯。利用质粒pNC9501和pBluescriptSK(-)构建大肠杆菌-红球菌穿梭质粒pBST,将mpd基因插入到质粒pBST中,构建得到了含有毒死蜱降解酶基因片段的质粒为pBSTG。本研究优化了玫瑰红红球菌的电转化条件,结果显示细胞培养至OD600值为0.4,制备的感受态细胞转化效率最高；使用不同浓度的甘油制备的感受态细胞的电转化效率明显不同,其中使用5%的甘油制备的感受态细胞的转化效率最高；电场强度也影响电转化的结果,场强为10kV/cm时电转化效率最高,研究中获得的转化效率最高达到8.0×104个转化子／μg质粒DNA。玫瑰红红球菌被作为受体细胞,质粒pBSTG导入玫瑰红红球菌中,得到的玫瑰红红球菌重组菌能够降解毒死蜱,通过在液体无机盐培养基中降解,工程菌在28h能降解50mg/1的毒死蜱。研究了在不同浓度抗生素对红球菌基因工程菌毒死蜱降解活力(μg毒死蜱／μg蛋白·h)的影响。结果显示当不添加抗生素,重组红球菌具有毒死蜱水解酶活性,达到0.028±0.004,而添加抗生素后毒死蜱活性会提高,最高可达0.057±0.007,说明即使在不添加抗生素的情况下构建的玫瑰红红球菌工程菌也能够降解毒死蜱。