论文部分内容阅读
背景与目的作为目前医学影像诊断中最常用的方法,超声诊断是利用超声波在体内组织界面发生的反射和散射信号差异显示组织器官结构的异常信息,从而达到诊断疾病目的的技术。超声造影通过将与软组织回声特性明显不同,或声特性阻抗差异显著的物质注入血管或体腔内,增强对脏器或病变的显示,提高超声诊断的准确性。常规超声造影剂一般为包裹有气体的微泡,其产生声特性阻抗差异较大的液气界面,可以明显增强背向散射强度,此外富有弹性的外壳能产生丰富的非线性谐波信号,通过谐波成像技术选择性接收谐波信号,可以明显提高图像的信噪比。与CT、MRI等检测技术相比,超声微泡造影剂在微血管和组织灌注检测方面具有显像效果好、实时帧频高、无辐射损伤、相对廉价以及便于床边检查等优点。按照制备材料和方法的不同,超声微泡造影剂的发展经历了第一代游离微气泡超声造影剂、包裹空气的第二代超声造影剂,以SonoVue(声诺维)为代表的第三代微泡造影剂。上述超声微泡的膜层成分多采用蛋白质、磷脂及多糖等,制备的微泡常存在体循环稳定性差,半衰期短等不足。近年来的研究表明高分子聚合物是一种极具潜力的成膜材料,其制备的微泡造影剂具有更好的体内稳定性,而且生物相容性好,已成为目前超声造影剂研究的热点。本研究旨在通过对高分子聚合物材料聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)进行脂质修饰处理,从而提高壳膜的柔顺性,最终得到超声响应性好、体内循环稳定、载药量高的新型超声造影剂,为构建无创性超声引导药物递送的多功能平台提高新的策略。材料与方法1.第一部分多孔脂质PLGA微泡的制备及优化研究采用乳化溶剂蒸发法和真空冷冻干燥技术制备多孔Lipid/PLGA微泡,检测其理化及声学性质,优化制备流程及参数。观察Lipid/PLGA微泡表形结构,测量其粒径电位及壳膜杨氏模量,并配制成不同浓度梯度的溶液(0.025、0.05、0.1、0.2mg/mmL),检测其产生的二次谐波信号强度,记录其在体外的超声造影效果和持续时间。经尾静脉注射适量的Lipid/PLGA微泡,然后观察其在小鼠体内不同脏器的显影情况。在造影模式下以一定强度的超声脉冲作用于Lipid/PLGA微泡,然后对比击发爆破前后微泡体内外的图像及信号强度变化情况。2.第二部分多孔脂质PLGA微泡作为药物递送载体的研究利用上述经优化的方法及参数制备载阿霉素(Dox)的多孔Lipid/PLGA微泡,并检测其理化性质及声学特性。测定其粒径、电位、载药量及包封率,比较相同浓度的载药与不载药微泡在体外的超声造影效果。通过改变pH值(3.0、5.0、7.4)及声压(0、0.39、0.52、0.65MPa),检测Dox在体外的释放情况。将培养的4T1肿瘤细胞分别与PBS、Lipid/PLGA微泡、Dox-Lipid/PLGA微泡混合,然后通过CCK8检测不同声压处理后各组细胞的存活率。用细胞移植的方法构建50只BALB/C小鼠皮下移植乳腺癌模型,随机平均分为空白对照组(Control)、空白微泡超声组(Lipid/PILGA+US)、单纯药物组(Free Dox)、载药微泡组(Dox-Lipid/PLGA)和载药微泡超声组(Dox-Lipid/PLGA+US),每组10只。载药微泡超声组:尾静脉缓慢注射0.lmL载药微泡的同时,对瘤体进行超声辐照(频率1MHz、声压0.52MPa、占空比25%);空白对照组:尾静脉注射0.lmL生理盐水;空白微泡超声组:尾静脉缓慢注射0.lmmL空白微泡的同时,对瘤体进行与载药超声微泡组相同条件的超声辐照;单纯药物组:尾静脉注射0.lmL Dox水溶液(5mg/mL);载药微泡组:尾静脉注射0.lmL载药微泡。所有要加超声的小鼠隔两天辐照一次,时间3分钟/次,共三次。治疗期间观察小鼠的体重变化、肿瘤的生长情况,并进行生存分析。第一次治疗结束后用电子秤称量小鼠体重(2天/次),共9次;用游标卡尺测量瘤体直径(2天/次),计算瘤体体积,共9次;小鼠死亡后取肿瘤组织做H&E染色,TUNEL检测凋亡,Ki-67评价肿瘤细胞增殖抑制情况。结果1.第一部分多孔脂质PLGA微泡的制备及优化研究Lipid/PLGA微泡溶于PBS缓冲液后呈乳白色混悬液,光镜观察其形态规则,大小均匀,分散度好。扫描电镜(SEM)显示微泡冻干前表面光滑,冻干后表面形成多孔,透射电镜(TEM)可见内部的空腔。马尔文激光粒径仪检测出Lipid/PLGA微泡平均粒径为736.8±118.3nm,分散指数为0.19,Zeta电位为(-5.32土3.56)mV,原子力显微镜(AFM)示Lipid/PLGA微泡壳膜较普通PLGA微泡更柔软。在相同浓度条件下,Lipid/PLGA微泡产生的二次谐波信号强度与脂质微泡接近,远优于普通PLGA微泡。体外超声成像实验显示Lipid/PLGA微泡能产生较强的超声造影信号,并随着浓度的变化而变化,且性能稳定性,持续显影时间可达36 h。Lipid/PLGA微泡在体内能稳定显影,肝、肾、脾等脏器的灌注成像信号较强,30分钟后才出现较明显消退。体内外超声爆破实验结果示爆破后Lipid/PLGA微泡造影信号强度较爆破前均显著降低,显影信号几乎完全消失。2.第二部分多孔脂质PLGA微泡作为药物递送载体的研究Dox-Lipid/PLGA微泡溶于PBS缓冲液后呈红色乳液,光镜及扫描电镜(SEM)观察其形态规则,大小均匀,表面有孔稍欠光滑。激光共聚焦显微镜(LSCM)显示微泡呈鲜红色,分散度好。马尔文激光粒径仪检测出Dox-Lipid/PLGA微泡粒径为623±105nm,分散指数为0.15,Zeta电位为(-5.82±2.72)mV。在体外显像对比实验中,Dox-Lipid/PLGA与Lipid/PLGA微泡超声显像效果没有统计学差异。高效液相色谱法检测其包封率为72±1.5%,载药量为8±0.23%(w/w)。采用0、0.39、0.52、0.65MPa声压超声辐照处理,125h后药物累计释放率分别为5±3.2%、14±1.3%、21±2.2%、26±1.8%。当pH=3或5(声压为0.52MPa),125h后药物累计释放率分为47±2.5%和35±1.3%。将4T1乳腺癌细胞与载药微泡混合,荧光显微镜可观察到超声处理组(0.52MPa,lmin)胞内可见明显的红色荧光,而对照组胞内无红色荧光显示。经0、0.39、0.52及0.65MPa的声压辐照1分钟后,Lipid/PLGA微泡对肿瘤细胞没有明显的细胞毒性,细胞存活率分别为98±2.7%、96±6.3%、91±2.9%和 89±7.5%。相比之下,使用Dox-Lipid/PLGA微泡对肿瘤细胞进行相同的超声辐照处理,可显著降低细胞存活率,分别为88±6.7%、50±1.9%、31±4.3%和28±3.1%。制备的Dox-Lipid/PLGA微泡在体内能稳定显影,并能通过肿瘤组织的EPR效应,提高肿瘤区域微泡的聚集浓度和滞留时间。与对照组相比,空白微泡超声组对肿瘤的抑制作用不明显,游离药物组或Dox-Lipid/PLGA组对肿瘤均有抑制作用。载药微泡超声组的肿瘤生长抑制作用最强,达到86%的肿瘤抑制率(根据肿瘤体积计算),小鼠的中位生存时间增加到46天,而对照组为36天。这些结果表明,Dox-Lipid/PLGA微泡联合超声可以有效促进药物的释放,对肿瘤有良好的治疗效果。在动物实验期间,所有组的荷瘤小鼠体重均未显示出显著变化。组织化学结果分析示载药微泡超声组的肿瘤细胞出现核收缩、碎裂、坏死,对照组和微泡超声组未发现明显的恶性坏死。TUNEL检测分析也得到了相似的结果,显示载药微泡超声组有大量的凋亡肿瘤细胞,Ki-67免疫组化染色进一步显示载药微泡超声组的Ki-67阳性细胞水平最低。与对照组小鼠相比,静脉注射Dox-Lipid/PLGA微泡后主要内脏器官均未发现明显的病理异常。结论1.第一部分多孔脂质PLGA微泡的制备及优化研究成功制备了 Lipid/PLGA微泡,其形态规则,大小均匀,分散性好。冻干后的Lipid/PLGA微泡呈表面多孔,内部为空腔的囊腔样结构,其产生的谐波信号强度与脂质微泡相近,但远优于普通PLGA微泡。表面经脂质修饰后的Lipid/PLGA微泡壳膜富有弹性,较普通PLGA微泡更加柔软。Lipid/PLGA微泡具有良好的声学性能,在体内外均能增强对比成像,且体内循环稳定性好,能被一定能量的超声击裂,是一种具有良好应用前景的多功能超声造影剂。2.第二部分多孔脂质PLGA微泡作为药物递送载体的研究成功制备了载阿霉素(Dox)的Dox-Lipid/PLGA微泡,其包封率较高、粒径均匀、分散性好,具有良好的超声响应性。Dox-Lipid/PLGA微泡在体内能稳定显影,通过肿瘤组织的EPR效应,提高肿瘤区域微泡的聚集浓度和滞留时间,超声辐照可使微泡破裂,促使微泡中的药物释放,增加化疗药物在靶区域的释放浓度。Dox-Lipid/PLGA微泡联合UTMD有效抑制了肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,延长荷瘤小鼠的生存周期。