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目的1、对细粒棘球绦虫水通道蛋白(Eg AQPs)的序列和结构特性进行生物信息学分析,为研究其生物学功能提供基础。2、筛选以RT-qPCR方法检测棘球蚴EgAQPs基因转录表达状态的内参基因,并检测EgAQPs基因在棘球蚴发育不同时间的转录表达水平,为探讨EgAQPs基因转录表达水平变化与棘球蚴液形成或积累的关系提供依据。3、克隆Eg AQPs基因,并在非洲爪蟾卵母细胞中进行异源表达以验证其水通道蛋白的功能,为研究EgAQPs基因在棘球蚴液形成或积累中的作用及机制提供基础。方法1、对Eg AQPs蛋白的序列和结构特性进行生物信息学分析,并构建进化树,以比较EgAQPs与其他物种来源的AQPs之间的亲缘关系。采用ProtParam、MotifScan、Conserved Domain、TMHMM 2.0、Prot Scale等生物信息学在线分析程序,分析EgAQPs蛋白的理化性质、翻译后修饰位点、保守结构域、跨膜结构域、亲/疏水性等。采用Clustal omega程序对不同物种来源的AQPs进行多序列比对,并通过MEGA 6.06程序构建进化树。2、采用geNorm软件分析体内外发育不同时间棘球蚴常用内参基因的稳定性,筛选出具体实验条件下稳定的内参基因,并运用RT-qPCR方法检测Eg AQPs基因在棘球蚴体内外发育不同时间的转录表达量。建立细粒棘球蚴原头蚴体外培养模型和棘球蚴小鼠模型,通过geNorm软件分析ND1、ATP6、elp、actin和Act II 5个候选内参基因在棘球蚴体内外发育不同时间样本中的稳定性。以geNorm软件推荐的基因为内参,运用RT-qPCR方法检测EgAQPs基因在棘球蚴体内外发育不同时间的转录表达量。3、通过RT-PCR克隆EgAQPs基因,构建异源表达载体pCS107-Eg AQPs并在非洲爪蟾卵母细胞中验证其水通道蛋白的功能。收集细粒棘球蚴原头蚴,提取总RNA;设计合成引物并添加Eco RI和xho I酶切位点,通过RT-PCR扩增EgAQPs基因片段,并克隆到非洲爪蟾卵母细胞表达载体pCS107中,通过EcoRI/xhoI双酶切和测序鉴定阳性克隆;将EgAQPs cRNA注射入非洲爪蟾卵母细胞,观察在不同时间点的非洲爪蟾卵母细胞体积变化情况,并计算水导度值,验证其是否具有水通道蛋白的功能。4、提取非洲爪蟾卵母细胞总蛋白、胞质蛋白和胞膜蛋白,通过Western blotting检测EgAQP4和EgAQP9蛋白在非洲爪蟾卵母细胞膜上的表达情况。结果1、生物信息学分析结果表明9种EgAQPs蛋白(EgAQP、Eg AQP1、EgAQP4的3种转录本(accession number:CDS21745、CDS21752和CDS21753)、EgAQP9的2种转录本(accession number:CDS21164和CDS22736)、Eg AQPAn G和EgAQPFA-CHIP)均具有MIP超家族特征性结构,是MIP超家族成员。NPA基序在EgAQPs蛋白中并不保守,尤其是第一个NPA基序呈多样性。EgAQPs蛋白跨膜结构域的数目为0~5个。在通过邻接法构建的进化树中,9种EgAQPs蛋白划分为水通道蛋白和水-甘油通道蛋白两大分支:EgAQP9的2种转录本(accession number:CDS21164和CDS22736)属于水-甘油通道蛋白;EgAQP、EgAQP1、EgAQP4的3种转录本(accession number:CDS21745、CDS21752和CDS21753)、EgAQPAnG和EgAQPFA-CHIP属于水通道蛋白。2、经geNorm软件分析发现,在不同实验条件下细粒棘球蚴内参基因稳定性不同:actin和ActII为检测体外培养不同时间细粒棘球蚴原头蚴EgAQPs基因转录表达状态的理想内参基因,而ATP6和ND1为检测小鼠体内发育不同时间的棘球蚴囊壁生发层细胞EgAQPs基因转录表达状态的理想内参基因。以geNorm软件推荐的基因为内参,通过RT-q PCR方法检测棘球蚴体内外发育不同时间EgAQPs基因转录表达水平,结果表明EgAQP3、EgAQP4和EgAQP9在原头蚴中表达水平较高,在接种原头蚴感染小鼠后的第3~7个月的棘球蚴囊壁生发层细胞中表达水平很低,基本上检测不到;Eg AQP、EgAQP1、EgAQPFA-CHIP和Eg AQPAnG在体外培养不同时间的原头蚴和小鼠体内发育不同时间的棘球蚴囊壁生发层细胞中的转录表达水平均很低,基本上检测不到。3、以细粒棘球蚴原头蚴总RNA为模板,通过RT-PCR成功扩增了EgAQP3、EgAQP4和Eg AQP9基因。Eg AQP3的反向互补序列与EgAQP9的核苷酸序列一致性为99%,EgAQP3与EgAQP9蛋白序列的一致性为100%,说明Eg AQP3和EgAQP9蛋白由同一个基因编码,本研究将EgAQP3和EgAQP9统一为EgAQP9。构建异源表达载体pCS107-Eg AQP4和pCS107-EgAQP9,并在非洲爪蟾卵母细胞中进行水通道蛋白功能验证,结果表明EgAQP4和EgAQP9蛋白在非洲爪蟾卵母细胞中未显示水通道功能。4、通过Western blotting检测非洲爪蟾卵母细胞膜上EgAQP4和EgAQP9蛋白的表达情况,结果表明EgAQP9蛋白成功表达于非洲爪蟾卵母细胞膜上,但在非洲爪蟾卵母细胞总蛋白、胞质蛋白和胞膜蛋白中均检测不到EgAQP4蛋白的表达,提示EgAQP4蛋白不能在非洲爪蟾卵母细胞中表达。结论1、通过生物信息学分析发现,虽然EgAQPs蛋白是MIP超家族成员,但它们的跨膜结构域数目与经典水通道蛋白不同,而且NPA基序在EgAQPs蛋白中并不保守。2、通过geNorm软件筛选了棘球蚴体内外发育不同时间稳定的内参对EgAQPs基因的转录表达水平进行标准化。在小鼠模型实验中,与原头蚴相比,棘球蚴囊壁生发层细胞中EgAQPs基因的转录表达水平大幅下降。3、成功克隆了EgAQP3、Eg AQP4和Eg AQP9基因,EgAQP3和EgAQP9蛋白由同一个基因编码,本研究将EgAQP3和EgAQP9统一为EgAQP9。EgAQP4和EgAQP9蛋白在非洲爪蟾卵母细胞实验中不显示水通道功能。Western blotting检测到EgAQP9蛋白成功表达于非洲爪蟾卵母细胞膜上,但在非洲爪蟾卵母细胞总蛋白、胞质蛋白和胞膜蛋白中均检测不到EgAQP4蛋白的表达。4、基于以上结果,本研究得出如下假说:原头蚴EgAQPs基因的转录表达水平显著高于棘球蚴囊壁生发层细胞可能正好反映了原头蚴内充满实质细胞,实质细胞的生命活动需要EgAQPs的功能;原头蚴在小鼠体内长成继发棘球蚴的过程中,原头蚴的部分实质细胞死亡后的裂解液可能是构成棘球蚴液的成分;棘球蚴囊壁生发层细胞EgAQPs基因低表达或功能缺失则有利于生发层细胞的存活,因为囊壁外的水不能通过这些AQPs进入生发层细胞而使之裂解,同时棘球蚴囊内的水也不能通过这些AQPs进入生发层细胞而使之裂解,或者通过生发层细胞膜上的AQPs转移出棘球蚴囊壁,这些因素则有利于棘球蚴液的积累,使得棘球蚴包囊越长越大,且可以在中间宿主的器官或组织中长期存活。