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第一部分体外分析OPG对肝细胞糖代谢的影响目的:在体外探索OPG（骨保护素）对肝细胞糖代谢及胰岛素信号通路的作用方法:构建OPG过表达及抑制腺病毒,并通过感染肝模型细胞hepal1-6和L02细胞系,采用高糖高脂FFAs或葡萄糖胺Glc N造胰岛素抵抗模型。通过过碘酸希夫染色检测细胞中糖原含量变化。用试剂盒定量检测其糖原含量。用2-NBDG试剂盒检测细胞糖摄取能力。采用western blot技术检测糖代谢相关基因p-Ins R,t-Ins R,p-AKT,t-AKT,PEPCK,G6Pase蛋白水平的表达情况。结果:成功构建OPG过表达及抑制病毒并感染细胞,并建立胰岛素抵抗细胞模型。糖原染色及定量检测结果均显示OPG能抑制糖原合成。且OPG过表达处理后细胞糖摄取能力降低。western blot结果中,在胰岛素抵抗情况下,OPG过表达使PEPCK及G6Pase水平升高,并且胰岛素信号通路中关键因子p-AKT明显降低,而p-Ins R水平却无变化。结论:OPG能够调控肝细胞的糖代谢,且其可能是通过作用于Ins R的下游分子从而来调控糖代谢关键信号分子AKT的活性。第二部分OPG基因敲除对高脂诱导的小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响目的:在体内探索OPG基因敲除对肝细胞糖代谢及胰岛素信号通路的作用方法:将OPG敲除鼠纯合子和野生型小鼠在第8周时开始分成四组(SD-WT,SD-OPG-/-,HFD-WT,HFD-OPG-/-)进行高脂造模12周。在19周时进行GTT,ITT试验检测小鼠胰岛素抵抗模型是否成功。20周时通过眼球取血检测小鼠血清中各项生化指标,取小鼠肝脏石蜡切片,经过碘酸希夫染色观察肝脏糖原含量的变化。取肝脏组织用试剂盒方法定量检测其糖原含量。采用实时荧光定量PCR检测胰岛素信号通路相关基因TRB3,ATF4,ATF6,SIRT1等;糖酵解相关基因Gck,Pdk4等的m RNA水平的变化。采用western blot技术检测糖代谢相关基因p-Ins R,t-Ins R,p-AKT,t-AKT,PEPCK,G6Pase,p-GSK3β,t-GSK3β,p-AMPK,t-AMPK,p-PKC,t-PKC,p-JNK,t-JNK,p-mTOR,t-mTOR,Raptor,p-S6K1,t-S6K1蛋白水平的变化。结果:与普食喂养组相比,高脂造模组的GTT、ITT结果显示其曲线下面积均明显降低,说明造模成功。OPG-/-小鼠在胰岛素抵抗状态下GTT和ITT的曲线下面积较WT明显降低,并且OPG-/-小鼠血清葡萄糖水平较对照组明显降低,这些结果均提示OPG敲除能够改善小鼠胰岛素抵抗状态。肝脏切片糖原染色及肝糖原含量定量检测结果显示OPG-/-小鼠肝脏糖原含量增加。TRB3,ATF4,ATF6,SIRT1,Gck,Pdk4等的m RNA水平均无明显变化。western blot结果显示HFD-OPG-/-组的p-AKT,p-GSK3β较HFD-WT组表达明显增加;而p-AMPK,p-PKC,p-JNK无明显变化;PEPCK,G6Pase,p-mTOR,p-S6K1与对照组相比HFD-OPG-/-组明显降低,并且发现Raptor条带有明显移位。结论:OPG基因敲除鼠体内的结果与体外细胞部分结果一致,OPG敲除能够改善小鼠体内胰岛素抵抗状态。并且这一过程很可能是通过mTORC1信号通路进行调节的。第三部分OPG调节肝脏胰岛素敏感性的机制目的:深入探索OPG调控肝脏胰岛素敏感性的分子机制方法:将OPG在c57小鼠肝原代细胞中过表达,以及OPG-/-小鼠肝原代细胞的分离后,分析mTOR,raptor,S6K1,IRS1,AKT,GSK3β的变化。使用mTOR抑制剂rapamycin来验证OPG是否通过调控mTORC1从而负反馈调节p-AKT的水平。随后取Raptor KO小鼠肝原代细胞进行OPG过表达检测AKT,GSK3β的变化,进一步证实OPG是否通过调控raptor从而调控肝脏胰岛素信号通路。通过双标免疫荧光对OPG和Raptor进行检测,然后用Co IP的方法来验证OPG是否是通过直接与Raptor蛋白结合从而影响其功能的。使用CIAP（小牛肠道碱性磷酸酶）及phos-tag凝胶来验证OPG是否是使raptor磷酸化发生变化从而影响mTOR的功能。结果:原代肝细胞中增加的OPG水平会使p-mTOR,p-S6K1,p-IRS1ser水平明显升高,而使p-AKT,p-GSK3β水平显著降低;敲除OPG的细胞中p-mTOR,p-S6K1,p-IRS1ser水平明显降低,而p-AKT,p-GSK3β水平显著升高。加入雷帕霉素后能够消除OPG过表达升高p-IRS1ser的作用,并且使OPG过表达导致的p-AKT,p-GSK3β水平降低得到改善。同样的,Raptor敲除后得到的结果与加入雷帕霉素后的结果相似。双色免疫荧光试验图片结合Co IP结果显示OPG蛋白与Raptor蛋白间存在相互作用。Phos-tag凝胶实验结果显示Raptor条带明显拖带,并且当加入CIAP后改拖带消失。结论:OPG蛋白与mTORC1上的Raptor蛋白相互作用增加其磷酸化从而升高mTORC1的活性。OPG通过Raptor/mTORC1/S6K1/IRS1ser/AKT/GSK3β通路调控肝脏胰岛素敏感性及糖代谢。