随着人类基因组计划的完成和人类疾病相关基因的阐明,疾病的基因治疗备受瞩目。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因传输系统。目前,基因传输系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然具有较高的基因传递效率,但其临床应用存在着毒性和免疫原性等问题。因此,非病毒载体系统的研究成为另一重要的发展方向。非病毒载体具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点,其中阳离子脂质体是研究应用得最为广泛的非病毒载体。但由于阳离子脂质体在体内的稳定性和靶向性较差,常常只能采取局部注射的给药方式。 为了构建一种可供静脉内注射的、具有靶向传输作用的基因载体,本文设计用由海洋鱼类提取的天然产物鱼精蛋白,作为聚阳离子材料缩聚质粒DNA,再让脂质体与缩聚后的DNA相互作用,从而使脂质双层重新排列,最终形成结构紧密的脂质-聚阳离子-DNA复合物(Lipid-polycation-DNA complexes, LPD)。 本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌,并采用阴离子柱层析的方法分离纯化质粒。采用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含量进行了测定,纯度符合要求。 我们建立了用荧光染料Hoechst 33258来测定制剂中DNA含量的方法。采用薄膜-挤压法制备空白脂质体,然后与适量的鱼精蛋白-DNA复合物在室温孵育后,得到LPD;分别用单因素法和中心组合法优化了阳离子型LPD和阴离子型LPD的处方。 为了提高阳离子型LPD的物理化学及生物学稳定性,我们将其制备成冻干针剂。冻干后的LPD可以保持其结构的完整性。冻干后的LPD针剂外观饱满疏松,色泽均匀,表面细腻光洁,具有足够的强度;其粒径为132.5nm,Zeta电位为44.35mV,包封率为93.61%,微粒的形态和