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第一部分小鼠成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱的分析目的诱导小鼠成骨细胞矿化,研究小鼠成骨细胞矿化过程中microRNA表达谱的变化。方法体外手术分离培养新生小鼠颅骨原代成骨细胞,使用p-甘油磷酸(β-glycerophosphate)和抗坏血酸(ascorbic acid)诱导成骨细胞矿化,茜素红(Alizarin Red S)染色实验观察成骨细胞的矿化情况。建立了诱导小鼠原代颅骨成骨细胞矿化的细胞模型。应用miRNA微阵列技术,分析小鼠成骨细胞矿化过程中miRNA表达谱的变化。通过qRT-PCR方法验证表达明显变化的miRNA在小鼠成骨细胞矿化过程中的表达情况。选取表达显著降低的miR-93作为进一步的研究对象。结果(1)采用体外手术分离法成功从小鼠颅骨分离出原代成骨细胞。(2)p-GP和抗坏血酸诱导小鼠成骨细胞培养至7天后,可见茜素红染色阳性的矿化结节形成。(3)用miRNA microarray芯片检测小鼠成骨细胞矿化化过程中miRNA表达谱变化,发现差异表达的miRNA中表达明显上调的有3个,分别是：mmu-miR-98, mmu-miR-130a, mmu-miR-210;表达明显下调的有6个,分别是：mmu-miR-93, mmu-miR-103, mmu-miR-92b, mmu-miR-674, mmu-miR-351, mmu-miR-24。以mmu-miR-93表达下调最为明显。(4)对差异表达最明显的miRNA进一步行实时定量RT-PCR验证,发现定量PCR结果与芯片结果一致,表明miRNA芯片结果是可靠的。结论建立了诱导小鼠原代颅骨成骨细胞矿化的细胞模型。应用microRNA芯片发现小鼠成骨细胞矿化过程中,mmu-miR-98, mmu-miR-130a, mmu-miR-210表达明显上调,而mmu-miR-93, mmu-miR-103, mmu-miR-92b, mmu-miR-674, mmu-miR-351, mmu-miR-24表达明显下调。以mmu-miR-93表达下调最为显著。第二部分miR-93对成骨细胞矿化的功能研究目的研究miR-93在小鼠成骨细胞矿化过程中的作用。方法用p-GP和抗坏血酸诱导小鼠成骨细胞矿化,Northern印迹杂交检测1niR-93在此过程中的表达模式。根据1miR-93前体序列设计引物,用PAJ-U6-CMV-eGFP vector合成miR-93慢病毒稳定表达载体pre-miR-93。将pre-miR-93转染小鼠成骨细胞,构建pre-miR-93过表达细胞模型,加入p-GP和抗坏血酸诱导分化,Northern杂交检测miR-93表达变化,茜素红染色观察成骨细胞矿化水平。结果(1)抗坏血酸和P-GP诱导小鼠成骨细胞矿化过程中,随着诱导时间延长,miR-93表达逐渐降低。(2)用PAJ-U6-CMV-eGFP vector成功构建miR-93慢病毒稳定表达载体pre-miR-93,能在细胞中高表达1niR-93。(3)miR-93过表达能抑制成骨细胞矿化形成,降低矿化结节茜素红定量。结论构建了miR-93表达载体,过表达miR-93可以抑制小鼠成骨细胞矿化。第三部分miR-93调控成骨细胞矿化的机制研究目的预测并验证miR-93与其作用的靶基因间的相互作用,阐明miR-93/Sp7调控环路在小鼠成骨细胞矿化的作用机制。方法用TargetScan和rna22等靶基因预测软件分析得到小鼠原miR-93的靶基因。将含有miR-93结合位点的靶基因Sp7(trans-acting transcription factor7, Osterix) CDS片段克隆到pGL3载体,构建野生型报告载体WT-pGL3-Sp7-CDS。用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒构建了含有突变靶位点的突变型报告载体MUT-pGL3-Sp7-CDS。将这两个载体分别与pre-miR-93或对照(1niR-C)共同转染小鼠成骨细胞,检测荧光素酶活性变化以证实该靶基因是否为miR-93作用的靶基因。小鼠成骨细胞单独转染pre-miR-93, Western印迹杂交和实时定量PCR分别检测靶基因Sp7蛋白和mRNA水平的变化,明确miR-93对靶基因Sp7的调控作用。PCR扩增Sp7的CDS区全长,连接到pAJ慢病毒表达载体构建野生型Sp7-CDS表达载体,同时用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒构建了含突变靶点的突变型Sp7-CDS表达载体。将这两个表达载体分别与pre-miR-93或miR-C共同转染小鼠颅骨成骨细胞,稳定转染后茜素红染色观察成骨细胞矿化小结的形成,靶基因蛋白表达用Western(?)迹杂交检测,进一步证实Sp7为niR-93在成骨细胞矿化过程中重要的靶基因。通过公布的小鼠转录起始位点(TSS)预测文库,根据第四位赖氨酸三甲基化的H3组蛋白(H3K4me3)在TSS位点周围的富集与启动子CpG岛为主要标识,预测miR-93的TSS。运用TF-seach转录因子结合位点预测软件分析miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列,预测miR-93启动子区可能结合的转录因子。通过凝胶迁移滞后实验(EMSA)、染色质免疫沉淀法(ChIP),验证Sp7与所预测结合位点的相互关系。采用转录因子荧光素酶报告基因活性进一步验证Sp7与miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列的结合及对1niR-93的转录抑制作用。通过PCR扩增Sp7cDNA并亚克隆至pAJ载体,构建Sp7表达载体pAJ-Sp7,慢病毒稳定转染成骨细胞,并构建特异性阻断Sp7蛋白表达的慢病毒短发卡RNA(shRNA)-Sp7表达载体,转染成骨细胞,建立稳定转染,分别采用Northern blot和qRT-PCR检测miR-93的表达,研究Sp7对miR-93表达的调控作用。结果(1) TargetScan和rna22等靶基因预测软件预测Sp7为miR-93作用的靶基因。(2)与转染1niR-C对照组相比,pre-miR-93和WT-pGL3-Sp7-CDS共转染组的荧光素酶活性受到明显的抑制,而pre-miR-93和MUT-pGL3-Sp7-CDS共转染组的荧光素酶活性则无明显变化。(3)单独转染pre-miR-93可以降低Sp7蛋白水平,而对Sp7mRNA水平无影响。(4) pre-miR-93与WT-pAJ-Sp7共同转染能减少成骨细胞矿化,降低Sp7蛋白表达水平；而pre-miR-93与MUT-pAJ-Sp7共同转染不能降低成骨细胞矿化水平,对Sp7蛋白水平没有影响,突变型Sp7CDS全长可以消除miR-93所致的对成骨细胞矿化的抑制作用及其对Sp7蛋白表达的抑制作用。(5) TF search转录因子预测软件预测Sp7在miR-93的TSS上游2kb内的DNA序列的结合。(6)凝胶迁移滞后实验(EMS A)示Sp7蛋白与靶结合位点的结合,特异性Sp7抗体验证了Sp7的存在,靶结合位点的突变则无蛋白质与结合结合位点的结合。(7) ChIP实验证实Sp7结合于所预测的转录因子结合位点。(8)与转染control对照组相比,Sp7和WT-pGL3-promoter共转染组的荧光素酶活性受到明显的抑制,而Sp7和MUT-pGL3-miR-93-promoter共转染组的荧光素酶活性则无明显变化。因此,我们认为miR-93主要通过抑制Sp7蛋白表达来抑制成骨细胞矿化,而Sp7可以通过抑制miR-93的转录来促进成骨细胞的矿化。(9)单独转染Sp7可以降低1niR-93的表达水平,而单独转染sh-Sp7可以提高miR-93的表达水平。结论(1)构建了野生型和突变型Sp7CDS荧光素酶报告基因载体、miR-93表达载体、野生型和突变型miR-93启动子区靶结合序列荧光素酶报告基因载体以及野生型和突变型Sp7CDS全长慢病毒表达载体。(2)通过靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实Sp7为miR-93作用的靶基因,且通过靶基因预测软件预测并经凝胶迁移滞后实验、染色质免疫沉淀实验、启动子荧光素酶报告基因检测证实Sp7为：niR-93的转录因子,且抑制其转录活性。(3) miR-93在转录后水平抑制Sp7表达,抑制成骨细胞矿化。Sp7作为miR-93的转录因子,抑制miR-93的转录,促进成骨细胞矿化。Sp7是miR-93和Sp7形成了相互制约的调控环路,并在成骨细胞矿化过程中起重要的调控作用。