目的:植酸,Inositol Hexaphosphate(IP6),多年来一直被视为是一种影响人体金属离子吸收的抗营养因子。随着对植酸的探索不断深入,多种生物学活性逐渐被研究者们发现,在众多的生理功能中,植酸抗肿瘤的活性备受关注。本实验室前期研究发现植酸及其水解产物能够对结直肠癌产生抑制作用,并推测植酸及其水解产物抑制结直肠癌的作用机制可能与PI3K/AKT信号通路所介导的肿瘤增殖、凋亡和转移过程有密切的关系。本课题在前期研究基础上,通过制备植酸不同水解率产物,拟通过体内、体外两个角度,探讨植酸不同水解产物抗结直肠癌的作用及其机制。方法:1.植酸不同水解率产物的制备(1)植酸水解标准曲线的绘制:参照《GB/T11893-1989水质总磷的测定-钼酸铵分光光度法》实验步骤,将不同浓度的植酸进行完全消解,经显色后,借助酶标仪检测光密度,绘制植酸吸光度-浓度标准曲线。(2)植酸水解酶的选择:在两个植酸水解体系中分别加入小麦植酸酶与大肠杆菌植酸酶于37℃条件下水解8 h,每小时取样检测,依照吸光度-浓度标准曲线计算样品的水解率,分别绘制不同水解酶的植酸水解率-时间效应曲线,用于预估制备植酸不同水解率产物的水解时间。(3)植酸不同水解率产物的制备:通过植酸吸光度-浓度标准曲线以及植酸酶水解率-时间效应曲线,预估植酸水解时间并实时监测计算水解率,以10%水解率为间隔逐步停止水解,真空脱水获得其植酸不同水解率产物。2.植酸及其不同水解率产物通过PI3K/AKT通路对结直肠癌SW620细胞的抑制作用(1)采用细胞增殖抑制实验,观察不同浓度(1μg/m L~100μg/m L)的植酸及其不同水解率产物对HCT116、HT29、SW620以及CT26四种结直肠癌细胞的增殖抑制作用;(2)利用细胞迁移实验,观察植酸及其不同水解率产物对SW620细胞增殖活性的抑制作用效果;(3)q RT-PCR方法检测经植酸及20%、30%及90%水解率产物处理后SW620细胞后PI3K/AKT通路相关m RNA的表达情况;(4)通过Cell based ELISA法检测植酸及其不同水解率产物对AKT以及p AKT蛋白表达的影响,并使用AKT蛋白抑制实验验证Cell based ELISA所得结果;(5)通过蛋白-配体模拟结合实验筛选可与AKT蛋白结合的植酸次级磷酸化形式。3.植酸及其不同水解率产物对结直肠癌移植瘤小鼠模型PI3K/AKT/VEGF信号通路的影响(1)动物模型建立及分组:本课题通过两种干预方式对BALB/c小鼠进行造模:干预方式一(处理模型),将24只小鼠,按照体重情况进行随机区组分为4组:生理盐水组、30%水解率产物组、90%水解率产物组以及植酸组,将经生理盐水、30%水解率产物、90%水解率产物以及植酸处理后的CT26细胞接种到对应组别的小鼠右后背部皮下,2周后处死小鼠;干预方式二(干预模型),将常规培养的CT26细胞接种到小鼠右后背部皮下,待肿瘤体表结节达到1cm*1cm视为造模成功。以将24只造模成功的小鼠按照肿瘤结节大小按照随机区组分为4组:生理盐水组、30%水解率产物组、90%水解率产物以及植酸组,通过瘤内多点注射进行干预,每周2次,连续注射10周。(2)肿瘤组织病理学检查:HE染色观察肿瘤细胞组织病理学改变;(3)蛋白印迹(Western-blot)方法检测PI3K/AKT/VEGF信号通路相关蛋白的表达;(4)实时定量PCR(q RT-PCR)方法检测PI3K/AKT/VEGF信号通路相关m RNA的表达。结果:1.植酸水解标准曲线结果显示,植酸溶液浓度在0.25μg/m L至250μg/m L间可显示较好吸光度-浓度线性关系(y=0.0078x+0.0892,R2=0.9980)。通过分析植酸酶的植酸水解率-时间效应曲线结果发现,大肠杆菌植酸酶在1 h~5 h水解时间内,与植酸水解率具有较好的线性关系,时间效应曲线为(y=0.1507x-0.0027,R2=0.9921),小麦植酸酶在1 h~7 h水解时间内,与植酸水解率具有较好的线性关系,时间效应曲线为(y=0.0805x+0.0026,R2=0.9293)。2.植酸及其不同水解率产物通过PI3K/AKT通路对结直肠癌细胞的抑制作用(1)增殖抑制实验结果显示,不同浓度的植酸10%~90%水解率产物对四种结直肠癌细胞株的增殖具有不同程度的抑制作用。在1μg/m L~100μg/m L浓度下,植酸对四种结直肠癌细胞株皆未表现出增殖抑制效果,于之相比,20%,30%和90%水解率产物在SW620细胞株中、90%水解率产物在HT29细胞株中、70%水解率产物在HCT116细胞株中以及30%和90%水解率产物在CT26细胞株中皆显示出了优于植酸单体的细胞增殖抑制效果。(2)迁移实验结果表明,与对照组相比,植酸20%、30%、90%水解率产物能够降低SW620细胞的迁移活性,抑制率分别为50.2%、39.1%以及20.6%(P<0.05);(3)q RT-PCR检测结果显示:植酸20%、30%、90%水解率产物对SW620细胞PI3K、AKT及BAD m RNA的表达影响,差异无统计学意义(P>0.05);(4)Cell based ELISA结果表明,植酸20%和30%水解率产物能够降低p AKT蛋白的表达(P<0.05),并不影响AKT蛋白表达(P>0.05);(5)AKT蛋白抑制实验结果显示,当SW620细胞的AKT蛋白活性被抑制后,植酸和90%水解率产物可抑制细胞的增殖,抑制率分别为:30.7%和32.3%;(6)蛋白-配体模拟结合实验表明,植酸的次级磷酸化形式中只有IP4和IP5可与AKT蛋白结合。3.植酸及其不同水解率产物对结直肠癌移植瘤小鼠模型PI3K/AKT/VEGF信号通路的影响(1)荷瘤小鼠瘤重结果显示,处理模型中,30%、90%水解率产物组以及植酸组小鼠肿瘤平均重量明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),其中30%水解率产物组小鼠的瘤重低于植酸组,差异具有统计学意义(P<0.05);干预模型中,90%水解率产物组及植酸组小鼠肿瘤平均重量明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)q RT-PCR结果显示,与对照组相比,植酸组在两种动物模型中能够降低VEGF、PI3K、AKT、m TOR、BAD以及FKHR m RNA的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05);90%水解率产物组在两种动物模型中能够有效地抑制VEGF、PI3K、AKT、m TOR、BAD以及FKHR m RNA的表达,并且促进CASP9 m RNA的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)Western-blot结果显示,与对照组相比,植酸在两种动物模型中能够抑制VEGF、PI3K、AKT、p AKT、m TOR、BAD以及FKHR蛋白的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05);植酸90%水解率产物在两种动物模型中能够显著地抑制VEGF、PI3K、AKT、p AKT、m TOR、BAD以及KFHR蛋白表达,并且促进CASP9蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.05);处理模型中,30%水解率产物组小鼠肿瘤中p AKT蛋白的表达明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.植酸不同水解率产物对多种结直肠癌细胞增殖具有明显抑制作用,且在较低浓度下(1μg/m L~100μg/m L),植酸不同水解率产物可发挥比植酸单体更强的抗结直肠癌作用。2.植酸及其不同水解率产物可通过PI3K/AKT信号通路发挥抗结直肠癌的作用,但植酸不同水解率产物抗结直肠癌的机制不同,30%水解率产物可抑制AKT蛋白的激活,对结直肠癌初期转移产生抑制效果;90%水解率产物通过抑制PI3K/AKT/VEGF信号通路的激活,对结直肠癌转移初期及发展期产生抑制效果;3.IP4、IP5与PIP3具有类似的分子结构,能够与AKT蛋白特异性的结合,抑制AKT蛋白的活化,可能是植酸水解率产物抗结直肠癌的机制之一;4.在植酸水解标准曲线条件下,200μg/m L是制备植酸水解产物的最佳植酸浓度;大肠杆菌植酸酶,水解效率高,可用于制备植酸水解产物;