分泌蛋白是人类蛋白质组中很重要的一类蛋白质,大约占总蛋白的十分之一。人体中一些重要的酶、激素、细胞因子等都属于分泌蛋白。它还参与了细胞的增殖、分化、凋亡,细胞间的信号转导,个体的发育、血液凝固、免疫防御等过程。在研究胚胎发育的过程中发现了一个新的分泌蛋白Plac9。并由该研究结果可知Plac9可能影响胚胎的器官发育。但是,大量相关的资料显示,对该基因的功能研究尚为空白。首先,运用生物信息学的方法得知该基因在人类10号染色体长臂22.3区域,其cDNA全长691bp,含有4个外显子,能编码一个大小为10kd左右的小分子蛋白。然后再对该蛋白的二级结构和三级结构通过生物信息分析预测该蛋白多为α螺旋结构,其三级结构类似一个小弹簧。然后对该蛋白的疏水性和信号肽进行分析可知,该蛋白可能是一个分泌到细胞外的分泌蛋白。众所周知,分泌蛋白的分泌途径有经典途径和非经典途径2种,通过一系列蛋白与细胞内质网和高尔基体共定位的实验得知,Plac9蛋白是一个通过经典分泌途径分泌到细胞外的分泌蛋白。在对Plac9蛋白的结构和分泌途径分析后,进一步对其功能进行了分析。首先,检测了Plac9基因在各骨细胞系、肺细胞系、肝细胞系中的表达量的情况。其结果可知它在不同细胞系中表达量变化明显。通过大量的文献得知Plac9基因对肝脏的发育有着重要的作用,所以在肝细胞系中选择了Plac9基因表达量很低的人胚正常肝细胞系L02来进行后续的研究。我们先构建了过表达Plac9基因的L02细胞系,随后检测Plac9蛋白对L02细胞的增殖是否有影响。再通过MTT,克隆形成等实验,验证了Plac9蛋白能够抑制细胞的增殖。进一步地,Plac9蛋白是否能够影响细胞周期,我们通过流式细胞术分析可知,Plac9蛋白能使细胞阻滞在G2/M期。再检测相关周期蛋白基因在过表达Plac9基因的L02细胞系中的表达量。由结果可知,一些G2/M期相关的周期蛋白的表达量都有变化。随后需要验证到底是通过哪些信号通路起作用。进一步地,Plac9蛋白在细胞外是否发挥作用,我们通过对细胞培养液进行MTT等一系列实验证明该蛋白在细胞外确实能影响到细胞的活动。在第一部分中,我们将新基因Plac9在L02细胞中过表达。我们在第二部分中,利用CRISPR/Cas9这项新方法,对Plac9基因进行编辑。CRISPR/Cas9技术是最近普遍运用的一种基因编辑技术,它能在细菌和古细菌中形成一种免疫能力,对抗病毒的入侵从而保护自己。CRISPR/Cas9系统是通过复合物(crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA))使核酸酶Cas9蛋白在特定位置上剪切双链DNA,形成DNA双链断裂。然后细胞启动非同源重组修复功能来修复双链断裂,在修复过程中容易造成基因的缺失、突变或插入,随之破坏基因的表达,形成基因敲除。是否能运用该技术来构建Plac9基因的敲除细胞系,来对该基因进行更加深入地研究。利用该技术,我们首先设计了4对sgRNA,并将其与PX458载体相连,转染至293T细胞中。再利用流式细胞仪将转染好的细胞分选为单个细胞。等细胞经过半个月长起来后,对其进行鉴定。当测序结果显示基因编辑后,再用编辑过的细胞做Western bloting,验证Plac9基因是否被敲除。结果证明,我们成功构建了Plac9基因敲除细胞系,后续我们将进一步对Plac9基因进行深入研究。综上所述,我们研究结果表明,人类新基因Plac9所表达的蛋白是一种通过经典分泌途径分泌到细胞外行使功能的小分子蛋白质,它能抑制细胞的增殖也可以使细胞阻滞在G2/M期。我们通过CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除Plac9基因的293T细胞系,该细胞系对后续研究Plac9基因的功能有着重要的作用。