一、研究背景腰背痛严重影响人们的身心健康,据统计全世界高达80%的人在一生之中都有过类似经历,患有腰背疼痛的患者中相当大一部分需要进行外科治疗,给社会以及家庭都带来了沉重的经济负担。引起腰背疼痛的原因很多,最主要就是椎间盘退行性病变(简称退变)。而椎间盘退变病因复杂,涉及机械力学刺激,营养通路障碍,细胞凋亡等众多事件,目前尚不能完全明确椎间盘发生退变的具体机制。软骨层间蛋白(Cartilage intermediate layer protein,CILP)在关节软骨和椎间盘中特异性地表达,表达水平随着年龄升高而上调。在既往关于椎间盘退变相关基因的研究中,CILP基因被证实与椎间盘的退变的发生存在关联,其基因序列中第1184位点的脱氧核苷酸突变(single nucleotide polymorphism,SNP)被认为通过增强CILP对β-转录生长因子(TGF-β)的结合作用,竞争性地抑制该因子对其受体的结合,从而抑制TGF-β对髓核细胞的效应。另外在软骨组织中表达上调的CILP的N端序列可以抑制类胰岛素因子生长因子-1(IGF-1)对软骨细胞的促合成分泌效应,从而阻断该因子在基质修复方面的作用;另有研究报道CILP的C-terminal促进无机磷酸盐在动物软骨细胞中的蓄积,从而加速慢性软骨病变进程。不仅如此,近年有研究通过构建高表达CILP的转基因小鼠,并用MRI检测高表达CILP对椎间盘退变进程的影响,发现高表达CILP小鼠的尾椎间盘组织过早地出现了退变相关的低信号,提示高水平表达的CILP对椎间盘退变的启动效应。以上证据提示在退变椎间盘中异常高表达的CILP不仅仅是椎间盘退变程度的标志,更可能是加速退变进程的重要参与者。那么在退变椎间盘组织中异常高表达的CILP如何促进退变的进程?人类椎间盘的退变涉及复杂的调控机制,包括细胞自噬,凋亡,炎性因子浸润,基质合成抑制(aggrecan,CollagenII),分解性酶类上调(MMPs,ADAMTs)等,导致了椎间盘基质合成代谢和分解代谢的失调,最终导致基质稳态的破坏并产生一系列的后果,包括PH值,渗透压改变等,这些改变极大地恶化了椎间盘细胞所处的微环境。更重要的是由于椎间盘中高含水性的aggrecan等基质成分的丧失,抵御外界机械刺激的能力削弱,使得其中的细胞暴露于更大的机械力学刺激。而过大的机械力学刺激对于椎间盘髓核细胞的调控效应主要为促基质分解,加速了椎间盘基质稳态的破坏。因此在退变的椎间盘中,基质稳态的破坏是椎间盘退变进展的关键因素。那么CILP是否对基质的合成分解代谢平衡产生影响,进而影响退变的进程?解决该问题有助于明确CILP在退变椎间盘中的具体促退变效应。除了明确CILP对椎间盘基质稳态的影响以外,本课题组还进一步探索CILP的表达调控机制。目前尚没有研究可以解释CILP的表达为何在退变椎间盘组织中会显著上调。既往研究证实某些生长因子可以上调CILP表达(TGF-βand BMP-2),但由于椎间盘组织在退变过程中细胞数量减少以及残余细胞的退行性病变导致的生长因子分泌减少等原因,退变椎间盘组织中难以维持可以促进CILP高表达的生长因子水平。考虑到机械力学刺激是影响基质稳态的关键因素,机械刺激对髓核细胞可以产生依赖于刺激强度,刺激时间以及频率的调控效应,且机械力学环境恶化是加速椎间盘退变的重要机制,推测CILP的表达水平可能受机械力学刺激调控,过强的力学刺激可能是退变椎间盘组织中CILP表达升高的重要原因。通过解决以上问题,我们会初步明确CILP在退变椎间盘髓核组织中异常高表达的具体机制以及意义。二、研究方法1.搜集2016年在新桥医院骨科因创伤性骨折或者严重退行性病变需要行椎间盘摘除病人的髓核组织,术前利用MRI对患者髓核组织进行Pfirrmann分级(轻度退变组≤III,严重退变组≥IV),通过免疫组织化学技术以及光密度值测定,明确不同退变组的CILP表达水平差异;2.利用新桥骨科新引进的专业力学加载设备Flexcell-5000CTM,给予细胞不同时间,强度的张力性力学加载,Western Bloting以及RT-qPCR技术检测力学刺激对于细胞的CILP以及主要的基质合成表型(aggrecan和collagenII)的调控效应;3.以不同浓度的重组人CILP刺激髓核细胞72小时,western以及RT-qPCR技术检测处理后髓核细胞基质合成表型的表达;利用CILP siRNA转染髓核细胞48小时,western以及RT-qPCR技术检测CILP的表达沉默后髓核细胞主要基质合成表型的表达。三、结果1.免疫组织化学染色结果示严重退变组与轻度退变组的CILP表达水平差异明显,严重退变组的CILP光密度值远高于轻度退变组;2.5%的张力(轻度)刺激髓核细胞48小时后,CILP的mRNA水平无明显变化;10%的张力(中度)刺激髓核细胞48小时后,CILP的mRNA水平和蛋白水平下降显著,同时基质主要合成表型(aggrecan和collagenII)的mRNA和蛋白水平均显著升高;20%的张力(重度)刺激髓核细胞后,CILP的mRNA水平显著上调,且Smad3的磷酸化水平明显增强;提前使用S1S3特异性地抑制Smad3的磷酸化水平后,再给与相同力学刺激,CILP的mRNA水平与未加抑制剂相比明显降低;3.CILP的siRNA转染细胞48小时后,髓核细胞的CILP的mRNA水平和蛋白水平显著下降,同时主要基质合成表型aggrecan以及CollagenII的mRNA和protein水平均显著上调;高浓度的人重组CILP处理髓核细胞72小时后,aggrecan和CollagenII的mRNA和protein水平显著升高。四、结论1.CILP在人髓核组织中随着退变程度不同而不同,相较于轻度退变组,严重退变程度的椎间盘组织的CILP表达水平显著增强;本研究同既往动物实验中关于老化的椎间盘组织中的CILP表达上调结果相一致。既往关于关节软骨组织中CILP的研究中证实高表达的CILP通过促炎症效应加速软骨组织的退变。因此,推测在退变椎间盘组织中CILP的高表达可能不仅仅是退变程度的标志物,也可能作为促进退变的加速剂。2.机械力学刺激调控髓核细胞的CILP表达,且该调控效应存在时间依赖性和强度依赖性。(a)适宜程度的张力刺激显著上调基质合成表型的合成,同时抑制CILP的表达水平,这与健康组织中的基质合成表型和CILP的表达水平相吻合,因此推测在未退变的健康髓核组织中,适宜强度的张力刺激是维持基质合成相对活跃,同时CILP低水平表达的重要前提。(b)不同于低强度的张力刺激效应,过强的张力刺激显著上调了髓核细胞的CILP表达,提示机械力学刺激对髓核细胞CILP的表达存在着多样性的调控效应,当刺激强度超过一定阈值,调控效应甚至可能相反。结合之前的低张力刺激髓核细胞的研究结果,提示退变组织中CILP异常高水平的表达可能是椎间盘结构破坏导致受力环境改变所引起。(c)提前抑制Smad信号途径以后。高强度张力刺激对髓核细胞CILP表达的上调效应被显著抑制。提示Smad信号通路介导高强度力学条件下CILP表达上调效应。既往研究中证实,TGF-β通过激活Smad信号途径上调CILP表达,而MAPK信号途径可以通过间接激活Smad途径进而参与CILP的表达调控。因此推测Smad途径是CILP表达调控的终末途径,而机械刺激对Smad信号通路的激活可能涉及到MAPK信号通路以及其他信号通路的介导。3.CILP作为被髓核细胞分泌到胞外的蛋白,能够对髓核细胞自身分泌的基质合成表型产生抑制效应。我们前部分实验证实,严重退变椎间盘的椎间盘组织中CILP的表达水平明显高于轻度退变的椎间盘组织,因此推测CILP表达增高可能是髓核细胞基质合成水平降低的重要原因,而在退变组织中高水平表达的CILP通过加速椎间盘基质稳态的失调,进而参与椎间盘退变的进程。综上,机械力学刺激可以调控髓核细胞的CILP表达,且高强度的张力性刺激可以显著上调CILP表达,而高表达的CILP可能通过抑制基质合成表型进而促进椎间盘的退变。结合既往关于机械刺激调控椎间盘细胞基质稳态的研究,提示CILP可能是介导机械刺激调控基质稳态的重要媒介。不过,由于尚未完善机械刺激条件下,干预CILP表达后对基质稳态影响的实验,尚不清楚CILP是否是介导力学刺激调控基质稳态的主要途径,需要进一步研究证实。