WRKY是植物中一个转录因子大家族,参与植物生长发育、抗逆和次生代谢调控等过程。本实验室为研究烟草打顶伤害诱导根系烟碱合成能力增强的分子机制,对烟株打顶前后根尖组织不同层次“组学”数据进行综合分析,筛选出与打顶伤害刺激信号传导相关的一些差异表达CDS,其中克隆得到了一个WRKY-like基因的ORF,命名为NtWRKY-R1,初步研究发现该基因的表达水平与烟碱合成关键基因PMT的表达成负相关。为了深入研究该基因的调控机制,本研究克隆了NtWRKY-R 3’-UTR和5’-UTR;采用生物信息学预测了 5’-UTR序列中的顺式作用元件;并对NtWRKY-R1自身的调控功能进行了探讨,为进一步研究该转录因子在响应打顶伤害信号向根系传递调控网络中的作用奠定了基础。主要内容如下:（1）由于NtWRKY-R1启动子序列中也存在W-box元件,为了检验NtWRKY-R1是否存在自我调控,构建了NtWRKY-R1表达载体和RNAi载体,分别与NtWRKY-R1启动子::GUS载体共转染烟株叶片进行瞬时表达,结果显示,NtWRKY-R1转录因子具有自我调控功能。为了进一步分析该结果的准确性,分别将NtWRKY-R1过表达载体和RNAi载体转化具有稳定遗传表达的NtWRKY-R1 promotor-GUS BY2细胞,检测GUS活性结果显示,NtWRKY-R1过表达时GUS活性显著升高,而NtWRKY-R1 RNAi表达时GUS活性降低。这些数据表明NtWRKY-R1转录因子具有自我调控能力。（2）采用 RACE 方法克隆了NtWRKY-R15’-UTR 和 3’-UTR 序列,NtWRKY-R1 5’-UTR 序列包含了 117Nt,3’-UTR包含了 225Nt,得到了该基因的全长,为该基因的启动子克隆奠定了基础。生物信息学分析5’-UTR序列显示,其中包含有多种顺式作用元件,如组织特异性表达元件CACTFTPPCA、POLLEN1LELAT52和NODCON2GM,抗性相关元件CURECORECR、GT1GMSCAM4,代谢相关元件DOFCOREZM和光调节基因结合位点INRNTPSADB等,且含有一个特意的uORF。此外,将NtWRKY-R15’-UTR序列与WRKY基因家族两个烟草5’-UTR和两个拟南芥5’-UTR序列进行同源性比较,结果发现它们之间同源性非常低。与这些数据为进一步研究该基因在信号传导中的功能奠定了基础。3)由于烟碱合成关键酶PMT的启动子序列中存在W-box元件,为了采用EMSA检测NtWRKY-R1是否具有调节PMT的功能,构建了 NtWRKY-R1蛋白原核表达载体,发现NtWRY-R1能在大肠杆菌中完整表达,但全以包涵体形式存在。对其表达条件（表达温度、表达速率及IPTG浓度）优化后也无法得到可溶性蛋白,推测NtWRKY-R1蛋白的正确折叠需要真核细胞内某些酶或辅助因子的参与。综合结果表明,NtWRKY-R1蛋白在翻译起始阶段和翻译后修饰过程有着复杂的调控机制,推测其在基因调控网络中通过正反馈调节其自身的表达而行使功能。