细胞色素P450介导的麦二叉蚜对杀虫剂的抗性机制

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麦蚜是小麦上的重大害虫之一,通过直接刺吸植株汁液以及间接的传播病毒从而对小麦造成危害。本文以麦二叉蚜(Schizaphis graminum)为研究对象,经吡虫啉或氟啶虫胺腈处理24 h后,通过转录组测序技术筛选出差异表达显著的细胞色素P450基因,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)以及RNA干扰(RNAi)进行验证,筛选出具有解毒功能的主效P450基因。具体研究结果如下:1.采用带虫浸液法测定吡虫啉和氟啶虫胺腈对麦二叉蚜的毒力。结果表明,吡虫啉和氟啶虫胺腈对麦二叉蚜LC50分别为0.106和0.195 mg/L,这为麦二叉蚜解毒机制进一步研究及治理提供重要的理论基础和依据。2.分别用吡虫啉或氟啶虫胺腈(LC10)处理麦二叉蚜24 h后,然后建立转录组测序文库,同时进行Illumina RNA-seq测序处理,然后对转录组测序操作所得到的数据进行相关的处理分析。结果表明,吡虫啉处理麦二叉蚜后,19条被注释为细胞色素P450基因的unigenes上调,15条注释为细胞色素P450基因的unigenes下调;氟啶虫胺腈处理麦二叉蚜后,18个被注释为细胞色素P450基因的unigenes上调,15条注释为细胞色素P450基因的unigenes下调。3.通过荧光定量PCR测定12条P450 unigenes对吡虫啉响应情况,继而验证转录组测序的结果。荧光定量PCR分析结果显示10条P450 unigenes表达受吡虫啉显著诱导,2条不受吡虫啉的诱导表达,这与DGE文库结果基本一致(DGE结果中10条受吡虫啉的诱导,有2条不受吡虫啉的诱导)。其中CYP6A2、CYP6A13、CYP6A14和CYP4C1分别与棉蚜CYP6B和CYP4C基因同源,CYP3 clade和CYP4 clade的P450基因被认为够增强杀虫剂的抗药性。4.为了明确CYP6A13是否参与杀虫剂抗药性。利用RNA干扰技术,通过饲喂麦二叉蚜dsCYP6A13-370及dsCYP6A13-412,利用实时荧光定量PCR检测沉默效率以及干扰后对吡虫啉的敏感度。结果表明,喂养dsCYP6A3-412和dsCYP6A3-370 24 h以后,CYP6A13mRNA表达量都出现了明显的减少。饲喂dsCYP6A3-412和dsCYP6A3-370 48 h后,CYP6A13 mRNA表达量下降达到最低值,与对照组(dsGFP)相比,沉默效率分别达到55.1%和48.5%,随着时间的推移,CYP6A13 mRNA表达量仍然保持下调水平。为了进一步测定CYP6A13对杀虫剂的解毒作用,我们测定饲喂后麦二叉蚜对吡虫啉的敏感度。饲喂dsCYP6A13-412和dsCYP6A13-370 12、24、36、48、60 h后,然后经过吡虫啉24 h处理,处理组(dsCYP6A13-412)死亡率是对照组(dsGFP)的3.04、2.43、1.12、1.09和1.02倍;处理组(dsCYP6A13-370)死亡率是对照组(dsGFP)的3.46、2.61、1.06、1.13和1.05倍。这表明CYP6A3在麦二叉蚜对杀虫剂解毒过程中发挥重要的作用。
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