人膀胱癌中DNA甲基化对microRNA-203表达机制调控及其功能研究

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目的:生物信息学预测在人膀胱癌中潜在的受DNA甲基化调控的nicroRNAs,考查DNA甲基化抑制剂5-Aza-CdR对膀胱癌细胞的作用及对预测到nicroRNAs表达的影响;确定受DNA甲基化调控的microRNAs并检测其启动子甲基化状态;明确这些rnicroRNAs的细胞功能和靶基因,阐释其在膀胱癌发生发展过程中的作用。方法:首先通过多个在线数据库预测在膀胱癌中潜在的受DNA甲基化调控的microRNAs,并通过TargetScan, PicTar, miRanda等rnicroRNAs靶基因预测软件预测这些microRNAs的靶基因,继而对这些靶基因进行GO、pathway等功能聚类分析,考查这些靶基因主要的生物学过程、分子功能、分子组分和参与的信号通路。预测这些microRNAs与DNA甲基化调控信号通路间是否存在相互调控关系。其次,运用DNA甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理膀胱癌细胞系5637和BIU-87, MTT实验和流式细胞术检测5-Aza-CdR对膀胱癌细胞的生长影响;实时定量PCR检测上述预测nicroRNAs的表达水平在5-Aza-CdR处理前后的变化;MSP、BSP实验考查这些microRNAs启动子甲基化状态,确定受DNA甲基化调控的rnicroRNAs。再次,real-time PCR和western blot实验验证上述受DNA甲基化调控的microRNAs的靶基因。最后,运用MTT法检测nicroRNAs对细胞增殖的影响、划痕试验检测nicroRNAs对细胞迁移的影响、细胞流式术检测rnicroRNAs对细胞周期影响和caspase3/7实验检测细胞凋亡的情况,阐明microRNAs对膀胱癌发生发展的作用。结论:1.生物信息预测到在膀胱癌中与DNA甲基化相关的13个microRNAs,作为进一步实验考查对象。2.DNA甲基化抑制剂5-Aza-CdR能抑制膀胱癌细胞系5637和BIU-87增殖和阻滞细胞周期,并使hsa-miRNA-203启动子发生去甲基化,上调hsa-miRNA-203表达水平。3.体外过表达hsa-miRNA-203可抑制膀胱癌细胞增殖、促进凋亡和抑制迁移能力,hsa-miRNA-203在膀胱癌中起着抑癌基因的作用。
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