研究背景子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma, EC)是妇科最常见的恶性肿瘤,近年来其发病率逐年升高,且有年轻化的趋势。根据临床表现、病理诊断、流行病学及分子机制的不同,子宫内膜癌被分为两型,Ⅰ型子宫内膜癌,即子宫内膜样癌(Endometrial Endometrioid Carcinoma, EEC),而子宫内膜浆液性癌(Endometrial Serous Carcinoma, ESC)是典型的Ⅱ型内膜癌,其发病率虽仅占内膜癌发病率的10-15%,但分化差,侵袭性高,发现时多为晚期,预后不良,占到内膜癌死亡率的40%,其高死亡率与多数病例无法早期发现有直接关系,早期发现的ESC,病灶局限于宫体且无明显肌层浸润的,总体生存率达83-100%。相对于机制较为清楚的Ⅰ型内膜癌,目前对ESC机制的了解仍十分有限。ESC的发生发展过程可被概括为从正常静止期内膜(Resting Endometrium, RE)到癌前病变子宫内膜腺体异常增生(Endometrial Glandular Dysplasia, EmGD),再进一步发展为其早期未浸润阶段子宫内膜上皮内癌(Endometrial Intraepithelial Carcinoma, EIC),最终发展为典型ESC的过程。研究表明,TP53是ESC中最常见的突变基因,突变率达90%以上,其在肿瘤发生发展过程中起到了重要作用。ESC中其他常见的分子改变还包括HER2/neu过表达(50%以上)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)缺失(62%)、P16过表达(92%-100%)、IMP3过表达(91%)等。由于早期发现的ESC预后往往较好,所以早发现早诊断成为其治疗的关键。最新的ESC转基因小鼠模型(Genetically Engineered Mouse Models, GEMMs)通过特异性敲除子宫内膜上皮细胞Trp53基因,成功模拟了人类ESC的发生发展过程,不但形成了典型的ESC病变,还包含一系列可识别的与人类疾病过程相似的早期病变,如癌前病变EmGD、早期未浸润病灶EIC等。该模型的建立进一步验证了P53蛋白表达异常在ESC发生发展过程中的重要作用,同时为ESC的机制研究提供了非常重要的工具。高迁移率族蛋白A2 (High-mobility group A2, HMGA2)是一种能与DNA中AT富集序列特异性结合的非组蛋白分子,可通过改变DNA构象,介导转录调控,因其分子量小,在聚丙烯凝胶电泳中迁移率高而得名。HMGA2在胚胎组织中高表达,而在正常成人组织中基本不表达。近年来的研究表明,HMGA2在多种恶性肿瘤组织中存在过表达的现象,如胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、浆液性卵巢癌等,是一种癌胚蛋白。之前有研究表明,HMGA2在子宫内膜癌肉瘤中也存在过表达现象,但其在ESC中的表达情况及是否起到促癌作用目前未有研究。因此本课题主要致力于研究HMGA2在ESC中的表达情况、发生发展过程中的作用以及是否具有早期诊断价值。研究内容分为以下两部分：HMGA2在子宫内膜浆液性癌中的表达情况及其促癌作用二、HMGA2在子宫内膜浆液性癌中的早期诊断价值第一部分HHGA2在子宫内膜浆液性癌中的表达情况及其促癌作用研究目的之前已有研究表明HMGA2在多种恶性肿瘤中过表达,如胰腺癌、甲状腺癌、肺癌及浆液性卵巢癌等,且HMGA2能通过介导上皮一间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)促进肿瘤细胞浸润转移,并与这些恶性肿瘤的不良预后有关。但HMGA2在ESC中的表达情况及是否起到促癌作用目前未有研究。本研究通过检测ESC患者样本中HMGA2的表达情况来探明HMGA2在ESC中是否也存在过表达现象,并通过调控内膜癌细胞系中HMGA2的表达水平来检测其对ESC增殖及浸润转移能力的影响。研究方法收集ESC及EEC的病例样本,行免疫组化染色(Immunohistochemistry staining, IHC),分别观察HMGA2在其中的表达情况。提取不同子宫内膜癌细胞系的总RNA,检测HMGA2在各细胞系中的表达情况,选取合适的细胞系(SPEC-2和Ishikawa),通过病毒转染的方式上调HMGA2的表达,或通过siRNA转染干扰HMGA2的表达。过表达及干扰的效率得到验证后,行MTT实验及平板克隆形成实验检测内膜癌细胞系增殖能力的改变,通过Transwell小室实验检测内膜癌细胞系HMGA2过表达或干扰后迁移及侵袭能力的改变。进一步的体内试验则是通过裸鼠皮下荷瘤及尾静脉注射肺转移模型的建立来检测HMGA2表达改变后细胞系增殖及浸润转移能力的改变。结果免疫组化染色结果显示HMGA2在ESC中的表达阳性率达66.1%(39/59),在对照的EEC样本中阳性率仅为29.5%(18/61)。而MTT实验、平板克隆形成实验及体内裸鼠皮下荷瘤实验都显示HMGA2过表达可提高子宫内膜癌细胞系的增殖能力,裸鼠皮下荷瘤体积明显增大。Transwell小室实验及体内尾静脉注射肺转移模型则表明HMGA2过表达可提高内膜癌细胞系的浸润转移能力,HMGA2表达被干扰后,浸润转移能力降低。Western-Blot结果显示HMGA2对内膜癌细胞系浸润转移能力的促进是通过调节EMT实现的。结论HMGA2在ESC中过表达；HMGA2能促进内膜癌细胞系增殖、浸润转移能力;HMGA2促进肿瘤细胞浸润转移是通过介导EMT实现的。第二部分 HMGA2在子宫内膜浆液性癌中的早期诊断价值研究目的之前的研究表明ESC中最常见的基因异常是TP53基因突变,在ESC的发生发展过程中起到了关键作用,是目前ESC早期诊断最重要的分子标志物。但是P53检测并不能涵盖ESC所有的早期病变,由于P53在EmGD、EIC阶段免疫组化阳性率分别为43%、72%,所以到EIC阶段,尚有30%左右的病例无法检出。HMGA2在ESC中过表达,但其发生异常的阶段尚未明确,HMGA2是否为ESC发生发展过程中的早期事件有待研究。本研究通过检测HMGA2在人类ESC各阶段样本中的表达情况来研究HMGA2在ESC中发生异常的阶段,并进一步在建立的模拟ESC发生发展过程的转基因小鼠模型中加以验证。最后,联合分析HMGA2与P53在ESC发生发展过程中各阶段的表达情况,探讨HMGA2作为ESC早期诊断分子标志物的可能性。研究方法收集人类形态学正常子宫内膜、癌前病变EmGD及早期未浸润阶段EIC的样本,分别行免疫组化染色检测HMGA2的表达情况。而后为进一步验证人类样本中所得结果,通过Trp53l1/l1小鼠与Kspl.3-Cre小鼠杂交产生了基因型为Kspl.3-Cre/+;Trp553f1/f1的转基因小鼠模型,特异性敲除其泌尿生殖道上皮细胞中的Trp53基因,然后观察Trp53敲除后,小鼠子宫内膜组织形态学的改变及HMGA2在各阶段中表达情况的变化。最后,联合分析P53及HMGA2在ESC发生发展过程中各阶段的表达情况。结果人类组织免疫组化染色检测显示HMGA2在形态学正产的内膜组织中表达少见,28例样本中仅1例萎缩内膜及1例正常内膜中存在局灶性阳性。在EmGD中阳性率为41.2%(7/17),在EIC中阳性率为62.5%(5/8),到ESC中达66.1%(39/59),其阳性率呈逐渐升高趋势,表明HMGA2过表达出现于ESC发生发展的早期阶段。Trp53基因条件性敲除后的转基因小鼠成功长出了包括ESC在内的多种Ⅱ型子宫内膜癌,还包含一系列可识别的与人类疾病过程相似的早期病变,如癌前病变EmGD、早期未浸润病灶EIC等。HMGA2在其尚未发生形态学改变的正常的小鼠内膜组织中就有阳性表达,EmGD、EIC及ESC中HMGA2均为阳性,进一步验证了HMGA2过表达在ESC发生发展过程中是一早期事件。HMGA2过表达最早出现于20周龄左右,随着小鼠周龄增长阳性率越来越高,40-60周龄的实验组小鼠中HMGA2表达阳性率达60.7%(17/28),而60-80周龄的实验组小鼠中,HMGA2表达阳性率升高到84.6%(11/13)。P53及HMGA2免疫组化染色结果联合分析显示,HMGA2与P53联合诊断提高了ESC的早期诊断率。结论HMGA2在ESC的发生发展过程中是一早期事件；HMGA2可作为ESC早期诊断的标志物,与P53联合应用,提高早期诊断率。本论文重点阐述了HMGA2在子宫内膜浆液性癌(ESC)发生发展过程中起到的作用,及其作为早期诊断标志物的价值。创新之处主要表现为以下几点：1. 检测发现HMGA2在ESC中也有过表达现象；2. 对HMGA2在ESC发生发展中的作用进行了详实完整的体外、体内实验,验证了其对ESC增殖、浸润转移的促进作用,并表明HMGA2促进肿瘤细胞浸润转移是通过介导EMT实现的；3. 首次提出HMGA2在ESC中是一重要的早期事件,可作为ESC早期诊断的标志物,与P53联合应用,可提高其早期诊断率；4. 首次通过转基因小鼠模型检测HMGA2在ESC发生发展过程中的表达情况,为ESC机制的研究提供了重要工具。本论文尚存在不足之处,也将会是我们未来的研究工作方向。主要有以下几点：1.本论文对HMGA2促进ESC增殖、浸润转移进行了研究,但因为患者信息授权的限制,未能就HMGA2与ESC预后进行相关性研究,对于HMGA2是否与ESC的不良预后有关仍需进一步研究。2. 本论文对HMGA2与ESC化疗耐药是否有关未做研究,其药物敏感性改变仍需进一步的研究。3.本论文中发现晚期EEC中HMGA2也有过表达,虽然阳性率明显低于ESC,但HMGA2在EEC发生发展中出现异常的阶段及HMGA2在其他类型EC中的表达情况仍需进一步研究。4.本论文研究表明,HMGA2作为ESC的早期诊断标志物,与P53检测联合应用可提高ESC的早期诊断率,但由于样本数量相对较少,进一步的扩大样本实验仍需进行。5.研究表明,HMGA2的表达受到microRNA let-7的转录后负调控,let-7能否成为ESC靶向治疗的药物有待进一步研究。