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背景：激素性股骨头缺血性坏死在临床上较为常见,目前其发病机制尚不明确。研究表明,激素性股骨头缺血性坏死与骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力转变、成骨细胞凋亡增加相关。本实验是国家自然科学基金资助项目“早期激素性股骨头缺血性坏死的蛋白质组学动态分析”的一部分,前部分实验显示,早期激素性股骨头缺血性坏死动物模型股骨头组织的骨细胞凋亡增加,膜联蛋白A1表达下调,由此推测膜联蛋白A1表达下调可能导致骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力降低、成骨细胞凋亡增加。膜联蛋白A1是一种钙依赖的磷脂结合多功能蛋白,参与细胞分化及细胞凋亡的调控。然而,目前有关膜联蛋白A1基因表达水平的改变与激素性股骨头缺血性坏死发生之间的关系尚未明确,且未发现相关的文献报道。本研究分三部分。第一部分兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体的构建与鉴定目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,为后续观察沉默膜联蛋白Al对兔骨髓间充质干细胞和成骨细胞生物特性的影响,以及进一步探讨激素性股骨头缺血性坏死的发病机制奠定实验基础。方法：针对兔膜联蛋白Al基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1, PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒载体LV-shANXA1,并根据GFP的表达测定慢病毒的滴度。结果：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1-764、LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901LV-shANXA1-NC的滴度分别为3.7×108TU/L、4.1×108TU/L、3.6×108TU/L、3.7×108TU/L。结论：实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体。第二部分沉默膜联蛋白A1基因表达对兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力的影响目的：观察沉默膜联蛋白A1基因对兔骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力的影响。方法：取新西兰大白兔的全骨髓细胞进行体外培养和纯化,采用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞的纯度。用不同感染复数(MOI)值的慢病毒载体LV、shANXA1-NC感染骨髓间充质干细胞后测定细胞的感染效率,并筛选最佳的感染复数值。分别用慢病毒载体LV-shANXA1-764、 LV-shANXA1-844、LV-shANXA1-901感染骨髓间充质干细胞下调ANXA1基因的表达,采用Real time PCR不(?)Westem blot检测慢病毒载体对ANXA1基因的沉默效率,并筛选最高沉默效率的慢病毒载体。将体外培养的骨髓间充质干细胞分三组：RNA干扰组用慢病毒载体LV-shANXA1-901感染骨髓间充质干细胞下调膜联蛋白A1基因的表达；阴性对照组用携带无义基因序列的慢病毒载体LV-shANXA1-NC感染骨髓间充质干细胞；空白对照组不加任何干预措施。采用MTT法评估各组骨髓间充质干细胞的增殖能力；采用碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染色和碱性磷酸酶活性的测定评估各组骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。结果：纯化后的骨髓间充质干细胞CD44、CD105表达阳性率分别为97.2%和95.8%,而CD45阳性率为2.5%。LV-shANXA1对骨髓间充质干细胞的最佳感染复数的值为50。感染复数为50时,LV-shANXA1对骨髓间充质干细胞感染效率为(91.4土2.7)%。实时PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达70%以上。膜联蛋白A1表达下调后,骨髓间充质干细胞出现明显生长抑制(P<0.05),在随后成骨分化诱导后,细胞的碱性磷酸酶染色阳性率和碱性磷酸酶活性明显降低(P<0.05),且茜素红染色呈阴性反应。结论：慢病毒载体LV-shANXA1-901能有效沉默膜联蛋白Al基因在骨髓间充质干细胞中的表达；沉默膜联蛋白A1基因降低骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力。第三部分沉默膜联蛋白A1基因表达对兔成骨细胞凋亡的影响目的：观察沉默膜联蛋白A1基因对兔成骨细胞凋亡的影响。方法：将体外培养的骨髓间充质干细胞诱导分化成成骨细胞。用不同感染复数(MOI)值的慢病毒载体LV-shANXA1-N感染成骨细胞后测定细胞的感染效率,并筛选最佳的感染复数值。按最佳感染复数值的慢病毒载体LV-shANXA1-901感染成骨细胞下调ANXA1基因的表达,采用Real timePCR(?)(?) Western blot检测慢病毒载体对ANXA1基因的沉默效率。将骨髓间充质干细胞体外诱导分化成成骨细胞后分三组：RNA干扰组用携带针对膜联蛋白A1基因的短发夹RNA慢病毒载体LV-shANXA1感染成骨细胞下调膜联蛋白A1基因的表达；阴性对照组用携带无义基因序列的慢病毒载体LV-shANXA1-NC感染陈骨细胞；空白对照组不加任何干预措施。采用半胱天冬酶3活性测定、流式细胞术及Tunel法评估ANXA1基因表达下调对成骨细胞凋亡的影响。结果：骨髓间充质干细胞经成骨分化诱导14d后,细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为(95.0±3.6)%,茜素红染色呈强阳性反应。LV-shANXA1对成骨细胞的最佳感染复数的值为50。在感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为(92.6±3.7)%。Real-time PCR(?)(?)Western blot检测显示感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞ANXA1基因的沉默效率效率可达70%以上。ANXA1表达下调后,成骨细胞半胱天冬酶3活性升高,经流式细胞术(?)(?)Tunel法检测细胞的凋亡率增加,均高于空白对照和阴性对照组(P<0.05)。结论：慢病毒载体LV-shANXA1-901能有效沉默膜联蛋白A1基因在成骨细胞中的表达；沉默膜联蛋白A1基因促进成骨细胞的凋亡；膜联蛋白A1基因表达下调通过激活半胱天冬氨酸蛋白酶-3引起成骨细胞凋亡