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第一部分利用化学小分子将人胚胎干细胞诱导分化为神经干细胞
目的
为了获得足够数量的hNSCs，采用单层分化培养方法，利用化学小分子将hESCs分化为可用于移植的hNSCs。
方法
采用单层分化培养方法，将hESCs接种到经放射的小鼠胚胎成纤维细胞(radiative mouse embryonic fibroblasts, rMEFs)饲养层细胞上，加入SMAD信号通路抑制剂的化学小分子DMH1、SB431542，隔天换液，贴壁培养6天后，用dispase消化传代，按照1：2比例接种，继续培养6天，在贴壁培养12天后悬浮培养，在分化18-20天之后，将神经球消化成单个细胞，一部分贴壁到多聚鸟苷酸/层粘黏蛋白(PLO/Laminin)包被的盖玻片上继续培养，剩余细胞移植到大鼠体内。在细胞分化的不同阶段，用免疫荧光的方法检测相关功能标志物Foxg1、Otx2、Sox1、Nestin、Ki67、Pax6、Tuj1、Map2、Synapsin等的表达。
结果
1.在SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542的作用下，持续诱导hESCs10天，可出现典型的玫瑰花簇样的神经上皮细胞，该细胞可表达前脑标志物Foxg1、Otx2和神经上皮细胞的标志物Sox1、Pax6。
2.免疫荧光染色结果表明，在神经前体细胞阶段，细胞向背侧前脑的方向进行分化，表达前脑神经干细胞的标志物Ki67、Nestin、Foxg1，以及背侧前脑的标志物Pax6。
3.细胞在体外贴壁培养1个月，即分化50天后，可分化为成熟的神经元，该神经元为谷氨酸能神经元，细胞发出神经丝并且可表达突触蛋白的标志物Synapsin。
结论
通过单层分化培养方法，在分化的特定时期加入SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542，可将hESCs在体外诱导分化为前脑背侧的hNSCs，最终可分化为成熟的谷氨酸能神经元，并具有在细胞间形成突触连接的能力。
第二部分重复经颅磁刺激联合神经干细胞移植对脑缺血大鼠运动功能障碍的影响及其机制初探
目的
观察rTMS联合hNSCs移植对脑缺血大鼠运动功能障碍的影响，同时对其机制进行初步探讨。
方法
选择体重230-250g的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型,将造模成功的大鼠随机分成四组：(1)对照组(vehicle)：移植细胞培养基；(2)hNSCs移植组(hNSCs)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs；(3)rTMS治疗组(rTMS)：大鼠纹状体注射等量的细胞培养基，给予rTMS治疗；(4 )hNSCs+rTMS联合治疗组(hNSCs+rTMS)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs，同时给予rTMS的治疗。在大鼠造模成功后的第4天移植细胞，24h后给予rTMS的刺激，连续干预28天，同时各组大鼠每天注射免疫抑制剂环孢素A(10 mg/kg)。在造模前、细胞移植前、细胞移植后的不同时间点，通过抓力计、抓绳实验、提尾实验检测大鼠行为学的变化，在所有动物完成行为学检测后，一部分大鼠用10%水合氯醛深麻醉，断头新鲜取材，用蛋白印迹法westernblot检测相关蛋白BDNF、TrkB和p-TrkB的变化，另外一部分大鼠深麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛灌注取材，组织切片后用尼氏染色、免疫荧光染色法分别检测大鼠脑梗死体积及患侧SVZ区NSCs增殖情况。
结果
1.成功建立了SD大鼠MCAO模型，并进行了hNSCs移植和rTMS的治疗，各组大鼠生存率分析结果表明，vehicle组、hNSCs组、rTMS组和hNSCs+rTMS组之间大鼠存活率无统计学意义(P>0.05)。
2.各组大鼠梗死体积检测结果显示：与vehicle组相比，hNSCs+rTMS组大鼠皮质宽度指数值显著增大(P<0.05)。尼氏染色结果显示，与vehicle组相比，hNSCs+rTMS组大鼠脑组织的梗死体积明显减小，且有统计学意义(P<0.05)。3.动物行为学检测结果显示：在抓力计实验测试中，hNSCs+rTMS组与vehicle组、hNSCs组、rTMS组相比，大鼠偏瘫侧抓力显著提高(P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvshNSCs；P<0.01，hNSCs+rTMSvsrTMS)；rTMS组与vehicle组相比，大鼠偏瘫侧抓力的恢复有统计学意义(P<0.01)。在抓绳实验中，hNSCs+rTMS组与vehicle组、hNSCs组相比，大鼠前肢抓力明显提高(P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle；P<0.01，hNSCs+rTMSvshNSCs)；rTMS组与vehicle组相比，大鼠前肢抓力的恢复有统计学意义(P<0.05)；在抓力计实验和抓绳实验中，我们发现，与vehicle组、hNSCs组、rTMS组相比，hNSCs+rTMS联合治疗可促进大鼠神经功能较快恢复。在提尾实验中，hNSCs+rTMS组与vehicle组相比，大鼠神经功能改善有统计学意义(P<0.05)，其余各组之间无统计学意义(P>0.05)。
4.通过Ki67+/Nestin+共标检测大鼠患侧SVZ区内源性NSCs的增殖，结果发现，与vehicle组相比，hNSCs组、rTMS组、hNSCs+rTMS组NSCs增殖明显增多，且有统计学意义(P<0.05，hNSCsvsvehicle；P<0.01，rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle)；hNSCs+rTMS组与hNSCs组相比，NSCs增殖有统计学意义(P<0.01)。
5.Westernblot研究结果显示：与vehicle组相比，rTMS组BDNF、p-TrkB蛋白表达量明显增加，且有显著性差异(P<0.01)；hNSCs+rTMS组与vehicle组比较，BDNF蛋白表达量明显增加，且有统计学意义(P<0.01)，p-TrkB蛋白表达量显著增加，且有统计学意义(P<0.001)；hNSCs+rTMS组与hNSCs组比较，BDNF蛋白表达量明显增加，且有显著性差异(P<0.05)，p-TrkB蛋白表达量也明显增加(P<0.01)；各组之间TrkB蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)；与vehicle组相比，rTMS组、hNSCs+rTMS组p-TrkB/TrkB明显增加，且有显著性差异(P<0.01，rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle)；与hNSCs组相比，hNSCs+rTMS组p-TrkB/TrkB明显增加，且有显著性差异(P<0.01)。
结论
rTMS和hNSCs移植联合治疗改善MCAO大鼠运动功能的效果优于单一的hNSCs移植、rTMS治疗；rTMS治疗和(或)hNSCs移植不能提高脑梗死大鼠的存活率；联合治疗效果的机制可能与减小脑组织梗死体积、促进SVZ区NSCs增殖、激活BDNF-TrkB信号通路有关。
第三部分rTMS治疗对移植的hNSCs存活、增殖、分化的影响及hNSCs在体内重建神经环路情况
目的
将外源性hNSCs移植到MCAO大鼠的纹状体中，在rTMS干预下，观察rTMS对hNSCs存活、增殖、分化产生的影响及移植的hNSCs在大鼠体内成熟、形成突触连接的情况。
方法
选择体重230-250g的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，将造模成功的大鼠分成两组：(1)hNSCs移植组(hNSCs)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs；(2)hNSCs+rTMS联合治疗组(hNSCs+rTMS)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs，同时给予rTMS的治疗。在大鼠造模成功后的第4天移植细胞，24h后给予rTMS的刺激，连续干预28天，同时各组大鼠每天注射免疫抑制剂环孢素A(10 mg/kg)。在rTMS治疗干预28天后，用10%水合氯醛将大鼠深麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛灌注取材，组织切片后用免疫荧光法检测移植的hNSCs存活、增殖、分化情况；同时预留一部分hNSCs组的大鼠继续观察，至3个月时再麻醉处死，组织切片后进行免疫荧光染色。
结果
1.与hNSCs组相比，在rTMS的干预下，hNSCs+rTMS组大鼠移植细胞的存活数量显著增多，且有统计学意义(P<0.05)。
2.免疫荧光染色结果显示，与hNSCs组相比，hNSCs+rTMS组Ki67+/HuNu+百分比明显减少，且有显著性差异(P<0.05)，而hNSCs+rTMS组Tuj1+/HuNu+百分比较hNSCs组显著增加(P<0.05)。
3.在细胞移植3个月之后，移植的细胞仍可在MCAO大鼠体内存活；在细胞移植3个月之后，表达NeuN的成熟神经元明显增多，而增殖状态的移植细胞明显减少；且在细胞移植3个月之后，免疫荧光染色结果显示，移植的细胞可分化为谷氨酸能神经元，表达突触蛋白的标志物Synaptophsin。
结论
rTMS能促进移植hNSCs的存活，减少hNSCs的增殖，促进其向神经元方向的分化；在细胞移植3个月之后，hNSCs可分化为成熟的谷氨酸能神经元，且具有形成突触连接重建神经环路的能力。
目的
为了获得足够数量的hNSCs，采用单层分化培养方法，利用化学小分子将hESCs分化为可用于移植的hNSCs。
方法
采用单层分化培养方法，将hESCs接种到经放射的小鼠胚胎成纤维细胞(radiative mouse embryonic fibroblasts, rMEFs)饲养层细胞上，加入SMAD信号通路抑制剂的化学小分子DMH1、SB431542，隔天换液，贴壁培养6天后，用dispase消化传代，按照1：2比例接种，继续培养6天，在贴壁培养12天后悬浮培养，在分化18-20天之后，将神经球消化成单个细胞，一部分贴壁到多聚鸟苷酸/层粘黏蛋白(PLO/Laminin)包被的盖玻片上继续培养，剩余细胞移植到大鼠体内。在细胞分化的不同阶段，用免疫荧光的方法检测相关功能标志物Foxg1、Otx2、Sox1、Nestin、Ki67、Pax6、Tuj1、Map2、Synapsin等的表达。
结果
1.在SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542的作用下，持续诱导hESCs10天，可出现典型的玫瑰花簇样的神经上皮细胞，该细胞可表达前脑标志物Foxg1、Otx2和神经上皮细胞的标志物Sox1、Pax6。
2.免疫荧光染色结果表明，在神经前体细胞阶段，细胞向背侧前脑的方向进行分化，表达前脑神经干细胞的标志物Ki67、Nestin、Foxg1，以及背侧前脑的标志物Pax6。
3.细胞在体外贴壁培养1个月，即分化50天后，可分化为成熟的神经元，该神经元为谷氨酸能神经元，细胞发出神经丝并且可表达突触蛋白的标志物Synapsin。
结论
通过单层分化培养方法，在分化的特定时期加入SMAD信号通路抑制剂化学小分子DMH1、SB431542，可将hESCs在体外诱导分化为前脑背侧的hNSCs，最终可分化为成熟的谷氨酸能神经元，并具有在细胞间形成突触连接的能力。
第二部分重复经颅磁刺激联合神经干细胞移植对脑缺血大鼠运动功能障碍的影响及其机制初探
目的
观察rTMS联合hNSCs移植对脑缺血大鼠运动功能障碍的影响，同时对其机制进行初步探讨。
方法
选择体重230-250g的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型,将造模成功的大鼠随机分成四组：(1)对照组(vehicle)：移植细胞培养基；(2)hNSCs移植组(hNSCs)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs；(3)rTMS治疗组(rTMS)：大鼠纹状体注射等量的细胞培养基，给予rTMS治疗；(4 )hNSCs+rTMS联合治疗组(hNSCs+rTMS)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs，同时给予rTMS的治疗。在大鼠造模成功后的第4天移植细胞，24h后给予rTMS的刺激，连续干预28天，同时各组大鼠每天注射免疫抑制剂环孢素A(10 mg/kg)。在造模前、细胞移植前、细胞移植后的不同时间点，通过抓力计、抓绳实验、提尾实验检测大鼠行为学的变化，在所有动物完成行为学检测后，一部分大鼠用10%水合氯醛深麻醉，断头新鲜取材，用蛋白印迹法westernblot检测相关蛋白BDNF、TrkB和p-TrkB的变化，另外一部分大鼠深麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛灌注取材，组织切片后用尼氏染色、免疫荧光染色法分别检测大鼠脑梗死体积及患侧SVZ区NSCs增殖情况。
结果
1.成功建立了SD大鼠MCAO模型，并进行了hNSCs移植和rTMS的治疗，各组大鼠生存率分析结果表明，vehicle组、hNSCs组、rTMS组和hNSCs+rTMS组之间大鼠存活率无统计学意义(P>0.05)。
2.各组大鼠梗死体积检测结果显示：与vehicle组相比，hNSCs+rTMS组大鼠皮质宽度指数值显著增大(P<0.05)。尼氏染色结果显示，与vehicle组相比，hNSCs+rTMS组大鼠脑组织的梗死体积明显减小，且有统计学意义(P<0.05)。3.动物行为学检测结果显示：在抓力计实验测试中，hNSCs+rTMS组与vehicle组、hNSCs组、rTMS组相比，大鼠偏瘫侧抓力显著提高(P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvshNSCs；P<0.01，hNSCs+rTMSvsrTMS)；rTMS组与vehicle组相比，大鼠偏瘫侧抓力的恢复有统计学意义(P<0.01)。在抓绳实验中，hNSCs+rTMS组与vehicle组、hNSCs组相比，大鼠前肢抓力明显提高(P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle；P<0.01，hNSCs+rTMSvshNSCs)；rTMS组与vehicle组相比，大鼠前肢抓力的恢复有统计学意义(P<0.05)；在抓力计实验和抓绳实验中，我们发现，与vehicle组、hNSCs组、rTMS组相比，hNSCs+rTMS联合治疗可促进大鼠神经功能较快恢复。在提尾实验中，hNSCs+rTMS组与vehicle组相比，大鼠神经功能改善有统计学意义(P<0.05)，其余各组之间无统计学意义(P>0.05)。
4.通过Ki67+/Nestin+共标检测大鼠患侧SVZ区内源性NSCs的增殖，结果发现，与vehicle组相比，hNSCs组、rTMS组、hNSCs+rTMS组NSCs增殖明显增多，且有统计学意义(P<0.05，hNSCsvsvehicle；P<0.01，rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle)；hNSCs+rTMS组与hNSCs组相比，NSCs增殖有统计学意义(P<0.01)。
5.Westernblot研究结果显示：与vehicle组相比，rTMS组BDNF、p-TrkB蛋白表达量明显增加，且有显著性差异(P<0.01)；hNSCs+rTMS组与vehicle组比较，BDNF蛋白表达量明显增加，且有统计学意义(P<0.01)，p-TrkB蛋白表达量显著增加，且有统计学意义(P<0.001)；hNSCs+rTMS组与hNSCs组比较，BDNF蛋白表达量明显增加，且有显著性差异(P<0.05)，p-TrkB蛋白表达量也明显增加(P<0.01)；各组之间TrkB蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)；与vehicle组相比，rTMS组、hNSCs+rTMS组p-TrkB/TrkB明显增加，且有显著性差异(P<0.01，rTMSvsvehicle；P<0.001，hNSCs+rTMSvsvehicle)；与hNSCs组相比，hNSCs+rTMS组p-TrkB/TrkB明显增加，且有显著性差异(P<0.01)。
结论
rTMS和hNSCs移植联合治疗改善MCAO大鼠运动功能的效果优于单一的hNSCs移植、rTMS治疗；rTMS治疗和(或)hNSCs移植不能提高脑梗死大鼠的存活率；联合治疗效果的机制可能与减小脑组织梗死体积、促进SVZ区NSCs增殖、激活BDNF-TrkB信号通路有关。
第三部分rTMS治疗对移植的hNSCs存活、增殖、分化的影响及hNSCs在体内重建神经环路情况
目的
将外源性hNSCs移植到MCAO大鼠的纹状体中，在rTMS干预下，观察rTMS对hNSCs存活、增殖、分化产生的影响及移植的hNSCs在大鼠体内成熟、形成突触连接的情况。
方法
选择体重230-250g的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠，采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，将造模成功的大鼠分成两组：(1)hNSCs移植组(hNSCs)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs；(2)hNSCs+rTMS联合治疗组(hNSCs+rTMS)：大鼠纹状体移植2.5×105个hNSCs，同时给予rTMS的治疗。在大鼠造模成功后的第4天移植细胞，24h后给予rTMS的刺激，连续干预28天，同时各组大鼠每天注射免疫抑制剂环孢素A(10 mg/kg)。在rTMS治疗干预28天后，用10%水合氯醛将大鼠深麻醉后，用生理盐水、4%多聚甲醛灌注取材，组织切片后用免疫荧光法检测移植的hNSCs存活、增殖、分化情况；同时预留一部分hNSCs组的大鼠继续观察，至3个月时再麻醉处死，组织切片后进行免疫荧光染色。
结果
1.与hNSCs组相比，在rTMS的干预下，hNSCs+rTMS组大鼠移植细胞的存活数量显著增多，且有统计学意义(P<0.05)。
2.免疫荧光染色结果显示，与hNSCs组相比，hNSCs+rTMS组Ki67+/HuNu+百分比明显减少，且有显著性差异(P<0.05)，而hNSCs+rTMS组Tuj1+/HuNu+百分比较hNSCs组显著增加(P<0.05)。
3.在细胞移植3个月之后，移植的细胞仍可在MCAO大鼠体内存活；在细胞移植3个月之后，表达NeuN的成熟神经元明显增多，而增殖状态的移植细胞明显减少；且在细胞移植3个月之后，免疫荧光染色结果显示，移植的细胞可分化为谷氨酸能神经元，表达突触蛋白的标志物Synaptophsin。
结论
rTMS能促进移植hNSCs的存活，减少hNSCs的增殖，促进其向神经元方向的分化；在细胞移植3个月之后，hNSCs可分化为成熟的谷氨酸能神经元，且具有形成突触连接重建神经环路的能力。