目的肥胖与食欲调节紊乱关系密切。下丘脑乃摄食中枢,是机体调控摄食、调节能量代谢的关键部位。中枢食欲调节和能量代谢紊乱与胰岛素抵抗的发生发展密切相关。而胰岛素抵抗是肥胖及2型糖尿病早期发病的重要机理。所以,本实验以前期研究为基础,以高脂饲料喂养导致的胰岛素抵抗状态肥胖模型大鼠为研究对象,从肠道微生物群介导的脑肠肽的变化导致的中枢食欲调节和能量代谢紊乱出发,探究电针联合限食对胰岛素抵抗状态肥胖模型大鼠肠道微生物群结构和功能的调节,对肠-脑轴的调控,以及对胰岛素敏感性和体质量的影响的关系,进一步阐明电针联合限食通过调控肠道微生物群-肠-脑轴改善胰岛素抵抗状态肥胖的可能机制。方法100只健康SPF级Wistar雄性大鼠(8周龄)。从中随机选取15只喂以总热量为3.8kcal/g的普通饲料作为对照,剩余85只均喂以总热量为5.4kcal/g的高脂饲料进行造模。8周后,将喂普通饲料的大鼠随机挑选13只作为正常组,测量所有大鼠的体质量、肛鼻长,并计算Lee’s指.数,将达到肥胖标准的大鼠再随机抽取52只均分成模型组、电针组、限食.组以及电针联合限食组(n=13/组)。再从各组大鼠中随机挑选3只行高胰岛素-正葡萄糖钳夹术以检测大鼠的胰岛素敏感性,用以确定胰岛素抵抗造模成功。随后每组均取10只分别予以相应的干预方法。(1)正常组(n=10):喂以普通饲料,不予处理;(2)模型组(n=10):喂以高脂饲料,不予处理;(3)电针组(n=10):喂以高脂饲料,同时选取中脘、关元、足三里(后三里)、丰隆穴进行针刺。并加电针(韩式LH202H型)治疗,其中,同一侧的丰隆和足三里穴连接一对电极,关元和中脘穴连接另一输出的两个电极。选用连续波,频率为2Hz,强度为1m A。每周治疗3次,每次电针10分钟,总疗程为8周;(4)限食组(n=10):每天给予30%热量限制以进行饮食控制,单独饲养,共8周;(5)电针联合限食组(n=10):每天给予30%热量限制的同时予以电.针治疗(治疗方案与电针组相同),共8周。分别在干预前、干预的第2、4、6、8周对大鼠的进食量、体质量、肛鼻长进行测量,并根据公式计算Lee’s.指数。且在各种干预方法处理后第6周,分别测量所有大鼠的腹腔糖耐量以及腹腔胰岛素耐量。所有干预结束后,再在各组大鼠中随机选取3只进行高胰岛素—正葡萄糖钳夹术用以检测胰岛素敏感性。随后按检测需要对大鼠进行灌注取材或取新鲜粪便、血液、肠道、结状神经节以及脑组织等进行指标检测。(1)宏基因组学检测技术:大鼠在处死前,取其新鲜粪便检测肠道微.生物群的分布和特定菌群、代谢功能。(2)酶联免疫吸附试验:处死大鼠前,心尖取血,以检测胰岛素水平以及血清leptin、CCK的含量。(3)免疫印迹法(WB):分别检测大鼠结肠组织中leptin、leptin R、CCK、CCKR以及结状神经节和弓状核中p-STAT3的蛋白水平。(4)实时荧光定量PCR法:分别检测结肠组织中leptin、leptin R、CCK、CCKR的基因表达水平。(5)免疫组化法:检测迷走神经传出神经元中p-STAT3.蛋白表达水平;检测最后区和孤束核中C-Fos表达。结果1.电针联合限食可以降低胰岛素抵抗状态肥胖大鼠的进食量、体质量及血糖,改善胰岛素敏感性。(1)进食量结果显示:与正常组比较,模型组大鼠进食量明显增高(P<0.01)。干预4周后,与模型组比较,电针组大鼠的进食量明显下降,有统计学差异(P<0.05)。到干预的第8。周,差异具有非常显著性(P<0.01),提示电针能够抑制肥胖大鼠的进食量。而限食组和电针联合限食组因每天给予模型组进食量平均值30%的热量限制,故从第2周开始,两组大鼠进食量即明显少于模型组及电针组,差异具有非常显著性(P<0.01),但这并不能说明该两组大鼠的主动进食量下降,但至干预的第8。周,这两组大鼠的进食量仍然进一步减少,表明限食和电针联合限食能够抑制食欲。而在各个时间点,电针联合限食组相比于限食组,其进食量进一步下降,表明电针与限食在抑制食欲方面具有协同作用。(2)体质量结果显示:在干预的第0周,各组大鼠体质量与正常组比较,均明显增高(P<0.01),且均超过正常组大鼠体质量均值的20%。在干预的前4周,各组大鼠体质量均呈上升趋势。从第4周开始,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组大鼠体质量开始下降,且电针联合限食组的体质量下降明显(P<0.05)。而从第6周开始,电针组、限食组以及电针联合限食组的体质量均有显著下降(P<0.05,P<0.01),该趋势一直维持至第8周。而与电针组相比,电针联合限食组体质量明显减低(P<0.05)。(3)Lee’s.指数结果显示:在干预的第0周,各组大鼠Lee’s.指数与正常组比较,均明显增高(P<0.01)。在干预的前4周,各组大鼠Lee’s指数均呈上升趋势。从第4周开始,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组大鼠Lee’s.指数下降,且电针联合限食组的Lee’s.指数下降明显(P<0.05)。而从第6周开始,电针组、限食组以及电针联合限食组的Lee’s指数均有显著下降(P<0.05,P<0.01),该趋势一直维持至第8周。而与电针组比较,电针联合限食组Lee’s指数明显减低(P<0.05)。(4)血糖结果显示:在整个实验的过程中各设定的时间段,各组大鼠的空腹血糖之间比较,无统计学差异。在干预的第0周,各组大鼠餐后血.糖与正常组比较,均明显增高(P<0.01)。干预结束后,与正常组比较,模型组餐后血糖升高显著(P<0.01);与模型组相比,电针组、限食组与电针联合限食组的餐后血糖均明显下降(P<0.05,P<0.01);与电.针组比较,电针联合限食组餐后血糖明显减低(P<0.05)。(5)血清胰岛素结果显示:与正常组相比,模型组大鼠血清胰岛素含量明显升高(P<0.01)。经过干预,电针组、限食组与电针联合限食组的血清胰岛素含量明显低于模型组(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组血清胰岛素明显减低(P<0.05)。(6)胰岛素敏感性相关指标:IPGTT试验表明,各组大鼠的血糖在空腹状态下无统计学差异,在腹腔注射葡萄糖后30分钟升高且到达峰值,接着开始下降。与正常组比较,模型组从30分钟开始直至120分钟,血.糖均明显升高(P<0.05)。与模型组相比,电针组、限食组和电针联合限食组大鼠在30分钟至120分钟时的血糖均显著降低(P<0.01)。IPITT试验表明,各组大鼠的血糖在空腹状态下无统计学差异,在腹腔注射胰岛素后30分钟,正常组、电针组、限食组和电针联合限食组大鼠血糖下降幅度明显低于模型组(P<0.05)。60分钟后,各组大鼠的血.糖均逐渐回升。120分钟后,与正常组相比,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01)。与模型组相比,电针组、限食组和电针联合限食组大鼠血糖显著降低(P<0.01)。GIR结果表明:在干预的第0周,与正常组相比,造模成功的各组大鼠的GIR值明显降低(P<0.01),且造模的各组大鼠之间差异无显著性。干预结束后,与模型组相比,电针组、限食组和电针联合限食组大鼠GIR显著升高(P<0.01)。2.电针联合限食能调节胰岛素抵抗状态肥胖大鼠的血清脑肠肽含量及肠道微生物群的结构和功能(1)血清脑肠肽结果显示:与正常组相比,模型组大鼠血清CCK含量明显降低(P<0.01)。经过干预,电针组、限食组与电针联合限食组的血清CCK水平明显高于模型组(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组血清CCK明显升高(P<0.05)。与正常组相比,模型组大鼠血清leptin含量明显升高(P<0.01)。经过干预,电针组、限食组与电针联合限食组的血清leptin水平明显低于模型组(P<0.01)。与电。针组比较,电针联合限食组血清leptin明显减低(P<0.05)。(2)电针联合限食对胰岛素抵抗状态肥胖大鼠肠道微生物群结构的影响:与正常组相比,模型组大鼠肠道拟杆菌门、变形杆.菌门丰度明显减少,厚壁菌门丰度明显升高;与模型组比较,电针组、限食组和电针联合限食组拟杆菌门、变形杆.菌门丰度均有升高趋势,厚壁菌门丰度均有降低趋势。且模型组拟杆菌属、乳杆菌属、阿克曼西亚属及柔嫩梭菌属丰度明显减低,经电针和限食干预后,上述菌群属水平丰度明显升高,且电针联合限食组各菌属丰度与正常组更接近。属水平heatmap显示肠道微生物群结构和丰度比较,电针组、限食组和电针联合限食组肠道微生物群有相似性,且这三个干预组与正常组之间也有一定相似性,但模型组与其他各组之间差异显著。Beta多样性分析结果显示模型组样品的物种发生了较大的改变,而电针联合限食干预均可以调节改变的物种,使之接近正常物种,且电针联合限食组样品的物种与正常组最接近。(3)电针联合限食对胰岛素抵抗状态肥胖大鼠肠道微生物群COG聚类的影响:与正常组相比,模型组大鼠的肠道微生物群在能量产生与转化、氨基酸的转运与代谢、碳水化合物的转运与代谢、脂质的转运与代谢和无机离子转运与代谢方面COG蛋白功能聚类均降低;与模型组比较,电针组、限食组和电针联合限食组的以上功能COG蛋白功能聚类均有上升趋势。COG聚类heatmap比较,电针组、限食组和电针联合限食组有相似性,且三个干预组与正常组之间存在一定的相似性,但模型组与其他各组之间差异显著。(4)电针联合限食对胰岛素抵.抗状态肥胖大鼠肠道微生物群KEGG的影响:与正常组相比,模型组大鼠肠道微生物代谢功能明显减低。与模型组相比,电.针组、限食组和电针联合限食组肠道微生物代谢功能明显升高。而对于KEGG代谢通路聚类的影响,模型组在ko00785(脂肪酸代谢)、ko00640(丙酸代谢)、ko00650(丁酸代谢)、ko00230(嘌呤代谢)、ko00240(嘧啶代谢)、ko00030(糖磷酸通路)、ko00600(鞘磷脂代谢)、ko00400(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代谢)、ko00970(氨酰生物合成)的KEGG聚类降低。予电针联合限食干预后,上述代谢通路的KEGG聚类有逐渐升高的趋势。3.电针联合限食能调节胰岛素抵抗状态肥胖大鼠结肠组织脑肠肽及其受体的表.达(1)结肠组织CCK及CCKR表达结果显示:与正常组比较,模型组结肠组织中CCK及CCKR.蛋白含量与基因水平明显下降(P<0.05,P<0.01)。各种干预方法处理8周后,相比于模型组,电针组、限食组及电针联合限食组CCK及CCKR.蛋白含量与基因水平均显著上调(P<0.05)。与电针组比较,电针联合限食组结肠组织中CCK及CCKR.蛋白含量与基因水平明显升高(P<0.05)。(2)结肠组织leptin及leptin R表达结果显示:与正常组比较,模型组结肠组织中leptin的蛋白含量与基因水平明显上升(P<0.05,P<0.01)。各种干预方法处理8周后,相比于模型组,电针组、限食组及电针联合限食组leptin.蛋白含量与.基因水平均显著下调(P<0.05)。与电针组比较,电针联合限食组结肠组织中leptin.蛋白含量与。基因水平明显降低(P<0.05)。而与正常组比较,模型组结肠组织中leptin R.蛋白含量与基因水平明显下降(P<0.05,P<0.01)。各种干预方法处理8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组leptin R蛋白含量与基因水平均显著上调(P<0.05)。与电针组比较,电针联合限食组结肠组织中leptin R.蛋白含量与基因水平明显升高(P<0.05)。4.电针联合限食能提高胰岛素抵抗状态肥胖大鼠中枢对脑肠肽的敏感性(1)结状神经节中p-STAT3的蛋白表达结果显示:与正常组比较,模型组结状神经节中p-STAT3的蛋白表达显著降低(P<0.01)。干预8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组p-STAT3的蛋白表达均显著上调(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组结状神经节中p-STAT3的蛋白表达升高明显(P<0.05)。(2)弓状核中p-STAT3的蛋白表达结果显示:与正常组比较,模型组弓状核中p-STAT3.的蛋白表达显著降低(P<0.01)。干预8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组弓状核中p-STAT3的蛋白表达均显著上调(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组弓状核中p-STAT3.的蛋白表达升高明显(P<0.05)。(3)迷走神经传出神经元中p-STAT3.蛋白表达结果显示:与正常组比较,模型组迷走运动背核及疑核中p-STAT3.的蛋白表达显著降低(P<0.01)。干预8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组迷走运动背核及疑核中p-STAT3.的蛋白表达均显著上调(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组迷走运动背核及疑核中.p-STAT3.的蛋白表达升高明显(P<0.05)。(4)最后区中C-Fos表达结果显示:与正常组比较,模型组最后区中C-Fos表达显著降低(P<0.01)。干预8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组最后区中C-Fos表达均显著上调(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组最后区中C-Fos表达升高明显(P<0.05)。(5)孤束核中C-Fos表达结果显示:与正常组比较,模型组孤束核中C-Fos表达显著降低(P<0.01)。干预8周后,与模型组比较,电针组、限食组及电针联合限食组孤束核中C-Fos表达均显著上调(P<0.01)。与电针组比较,电针联合限食组孤束核中C-Fos表达升高明显(P<0.05)。结论1.电针联合限食能够减轻IR状态肥胖大鼠的体重及Lee’s指数,减少其进食量,显著降低血清胰岛素含量,增强IR状态肥胖大鼠的胰岛素敏感性。2.电针联合限食能够改善IR状态肥胖大鼠肠道微生物菌群的结构和功能,调节IR状态肥胖大鼠血清脑肠肽的含量,使其中脑肠肽leptin含量降低,而血清CCK的含量增加。3.电针联合限食能够显著提高IR状态肥胖大鼠结肠组织中脑肠肽CCK、CCKR和leptin R的蛋白和基因表达水平,而使leptin的蛋白和基因表达水平降低。4.电针联合限食可以提高IR状态肥胖大鼠中枢(下丘脑和脑干)对脑肠肽CCK和leptin的敏感性。5.电针联合限食通过改善IR状态肥胖大鼠肠道微生物群的结构和功能,调节IR状态肥胖大鼠血清及肠道脑肠肽含量,并进一步提高中枢(下丘脑和脑干)对脑肠肽CCK和leptin的敏感性,从而控制IR状态肥胖大鼠的食欲,减轻其体重,改善其胰岛素敏感性,且电针和限食在此过程中存在着协同作用。综上表明,电针联合限食可以通过调控肠道微生物群的结构和功能、脑肠肽的含量以及中枢对脑肠肽的敏感性,即通过调控肠道微生物群-肠-脑轴达到改善胰岛素抵抗状态肥胖大鼠的胰岛素敏感性及能量代谢的目的,且电.针和限食具有协同作用,这为临床上运用针灸配合限食干预肥胖及其相关疾病提供了实验依据。