背景:多发性骨髓瘤(MM)是一种中老年人多见的疾病,而且它是目前认为无法治愈的一种血液系统肿瘤,一般表现为恶性浆细胞的增生,同时还伴有骨痛、乏力等其他非特异性的临床症状,早期一般不易被发现,它一般可以侵犯骨骼,出现骨质的损害,同时也可以出现其他器官的损伤,其他脏器也会不同程度的累及,如甲状腺、消化系统、生殖系统,如果侵犯到心脏及肺脏时,甚至可以侵犯到心包或胸腔等组织,从而进一步引起全身多脏器损害,进一步引起代谢的紊乱,以及免疫功能的异常[1]。现阶段,我们主要采取化学治疗和造血干细胞的移植的方法治疗多发性骨髓瘤。虽然目前有各种新药的出现,缓解率及生存率有所提高,但最终会病情复发,但对于患者来说患者生存质量有待提高,长期生存不理想,同时由于病情反复、进展导致治疗效果差,同时肿瘤的易侵袭性,加之多发耐药这一普遍现象的存在,同时还有其他因素等原因,迫使我们要更深入的研究多发性骨髓瘤的新的致病基因及发病机制,来提升患者的治疗疗效。难治导致的治疗失败需要我们寻求新的细胞信号传导通路及致病因素以找到新的治疗靶点,因为肿瘤极容易复发及侵袭性的特点,更需要找到影响浸润、进展的致病基因及相关转录因子。故目前我们研究的焦点在防止肿瘤进展、浸润上。目前大多数研究认为多发性骨髓瘤与血管新生有关,它的发生、发展及髓外浸润与相关的细胞信号传导通路失活有关,同时与异常的细胞生物遗传学有关,既往研究表明多发性骨髓瘤的发生是一种多因素的事件,这些因素相互关联,相互影响及作用促进瘤细胞的生成及肿瘤的进程。多发性骨髓瘤的明确的致病因素目前需要进一步深入探讨,在研究的过程当值,发现了许多基因的高表达或者是某些特定基因的低表达,这些基因的异常表达可能与多发性骨髓瘤的发生有密切关系。资料显示,有一些细胞因子的分泌会直接刺激骨髓瘤细胞生长及增殖,这些细胞因子常常位于瘤细胞中或者微环境中的基质细胞中,目前认为与多发性骨髓瘤发病关系较密切的细胞因子有:血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMPs),如MMP-2与MMP-9,同时还发现以下细胞因子对瘤细胞有促进增殖及浸润的作用,包括:成纤维生长因子(b FGF)、白介素-8、血管生成素-1、骨桥蛋白(OPN)等。这些细胞因子可能受到某些细胞信号的刺激后,会分泌有所增加,同时与某些特定的癌基因相互作用,它们均有促进血管新生作用[2]。国内外的一些研究已经证实HOXB7基因可特异性诱导b FGF、GROa、VEGF等血管生长因子表达水平上调,激活PI3K/Akt信号传导途径,抑制内皮细胞的凋亡,然后进一步促进肿瘤血管生成、肿瘤的生长与转移。HOXB7基因促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及肿瘤细胞的血管生成等作用,在多种实体肿瘤细胞中已经得到证实,而其在造血系统肿瘤及造血细胞中的作用尚不清楚,关于HOXB7是否与多发性骨髓瘤的发生以及骨髓瘤的进展、浸润相关的资料较少,故是我们所研究的重点。因此,本文研究了转录因子HOXB7在不同临床分期的多发性骨髓瘤患者中的作用,同时检测了一系列相关基因的表达,为了更深入的明确HOXB7因子的作用,并了解HOXB7因子是否与多发性骨髓瘤发生、发展及浸润相关。同时通过HOXB7-si RNA瞬时转染多发性骨髓瘤细胞,使HOXB7因子的表达降低,从而对其他相关基因进行分子生物学的检测,比较转染前后表达的变化,明确多发性骨髓瘤致病基因,并为进一步治疗多发性骨髓瘤提供理论基础,从而阐述HOXB7基因可能与骨髓瘤的进展密切相关。国内外关于HOXB7与多发性骨髓瘤的关系方面,这一领域的研究相对较少,在此研究中,我们发现HOXB7基因在一部分多发性骨髓瘤患者中有表达,同时存在表达的患者容易出现病情进展及髓外浸润,具有潜在的促血管新生及促进细胞增殖的作用,对多发性骨髓瘤的病情进展有促进作用。通过si RNA转染多发性骨髓瘤细胞,使HOXB7基因下调,检测其他相关基因的表达情况,进一步说明它在多发性骨髓瘤中的作用,寻找治疗多发性骨髓瘤的新的靶点。把研究分为三部分:第一部分转录因子HOXB7在多发性骨髓瘤患者中的临床意义目的:应用实时荧光定量PCR的方法检测多发性骨髓瘤患者中HOXB7m RNA及其应用Westernblot的方法检测其蛋白水平,阐述它在多发性骨髓瘤中的作用机制,并且纯化分离多发性骨髓瘤患者的骨髓单个核细胞,并分析MM患者中HOXB7因子在不同的多发性骨髓瘤临床阶段的情况,明确HOXB7与骨髓瘤的进展及髓外浸润的关系。方法:采用CD138抗体把MM细胞进行分离纯化临床收集的49例MM患者骨髓单个核细胞,并同时取患者骨髓组织及骨髓上清液,采用20例缺铁性贫血患者作为对照组,将患者按Durie-Salmon分期和是否伴有髓外浸润进行分组,进行分析。应用免疫组化的方法进行骨髓组织的化学染色,并用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测HOXB7的表达,Western blot法测定其蛋白表达水平,用ELISA的方法检测骨髓上清液中的蛋白含量结果:1 49例MM患者中,其中有35例MM患者表达HOXB7 m RNA,其表达水平为(0.466±0.148),20例对照组的表达水平为(0.179±0.061),二者相比有显著差异(P<0.01)。我们应用Durie-Salmon分期,把MM患者分为两组。Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期。其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者组21例,HOXB7 m RNA表达水平为(0.372±0.131)。Ⅲ期MM患者组28例,HOXB7 m RNA表达水平为(0.561±0.099),并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者组分别与对照组做比较,结果显示有统计学意义(P<0.01),而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者组和Ⅲ期MM患者组进行比较后,结果显示差异显著(P=0.018;P<0.05)。在所有MM患者的标本中行WNT5A m RNA的检测,结果发现WNT5A m RNA的表达水平为:(0.588±0.225),对照组的表达水平为(0.192±0.011),Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者组的表达水平分别为(0.426±0.133),(0.751±0.176),两者相比后显示,差异显著(P=0.005;P<0.01),与对照组比较后结果显示P<0.01,差异显著,有统计学意义。在所有MM患者的标本中行VEGFA,MMP2,b FGF,MMP9,Cyclin D1m RNA的表达水平的检测,Ⅰ+Ⅱ期患者的表达水平分别为(0.826±0.327),(1.726±0.462),(1.026±0.215),(0.735±0.109),(1.726±0.319),Ⅲ期MM患者组为(1.204±0.662),(2.336±0.421),(2.273±0.406),(2.261±0.520),(1.836±0.402),与对照组比较(P<0.05),把Ⅰ+Ⅱ期MM患者组和Ⅲ期MM患者组进行比较后,结果显示差异显著(P<0.01)。2在III期MM患者中,其中伴有髓外浸润的患者有9例,不伴有髓外浸润的患者有19例,其中伴有髓外浸润的患者的HOXB7m RNA的表达为(0.751±0.176),不伴有髓外浸润的HOXB7m RNA患者表达为(0.639±0.051),经过统计学分析显示差异显著(P<0.05),WNT5A m RNA在伴有髓外浸润的患者的表达为(0.896±0.105),不伴有髓外浸润的患者表达为(0.605±0.056)。二者与对照组相比有统计学意义,(P<0.01)。二者相比,统计学分析有显著差异(P<0.05)。3根据NCCN指南里治疗多发性骨髓瘤中,多发性骨髓瘤患者的治疗的疗效标准,把多发性骨髓瘤患者分为newly diagnosed,s CR,CR,VGPR,PR,SD,progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR.对MM患者行Western blot的检测。Newly diagnosed(初治)MM患者20例,s CR MM患者5例,CR MM患者3例,VGPR MM患者1例,PR MM患者2例,SD MM患者5例,共计16例病情稳定的患者,progressive disease MM患者3例,clinical relapse MM患者6例,relapse from CR MM患者4例,共计13例复发及病情进展的MM患者。在49例MM患者选取Newly diagnosed、(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者、(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者各6例,对照组选取10例,其中10例对照组HOXB7蛋白平均表达水平为(0.075±0.026),18例MM患者的HOXB7蛋白的平均表达水平为(0.268±0.127),其中Newly diagnosed组HOXB7蛋白的平均表达水平为(0.278±0.050),(s CR及CR、VGPR、PR、SD)组MM患者与(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者组HOXB7蛋白的平均表达水平为分别为(0.199±0.039),(0.327±0.131)。初治的MM患者与复发、病情进展的MM患者,分别与病情稳定的MM患者相比较,结果显示有差异显著(P<0.01)。而把初治MM患者与复发及病情进展的MM患者相比较后,结果显示无统计学意义(P>0.05)。初治患者组、复发及病情进展的MM患者分别与对照组比较,结果有显著差异(P<0.01)。在选取的这些患者中其中Ⅰ+Ⅱ期MM患者组6例,HOXB7平均表达水平为(0.216±0.047)。Ⅲ期MM患者组12例,HOXB7蛋白平均表达水平为(0.320±0.114),并把Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期MM患者组分别与对照组做比较,结果显示有统计学意义(P<0.05),而把Ⅰ+Ⅱ期MM患者组和Ⅲ期MM患者组进行比较后,结果显示差异显著(P<0.01)。WNT5A蛋白在Ⅰ+Ⅱ期MM患者的平均表达水平为(0.398±0.136),Ⅲ期MM患者组平均表达水平为(0.549±0.142),与对照组表达水平有显著差异P<0.05,二者比较有统计学意义P<0.01。4对Newly diagnosed、(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者、(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者各6例行WNT5a,VEGFA,MMP-2,β-catenin,MMP-9,Cyclin D1,survivin蛋白的检测,其中MMP-2、β-catenin、VEGFA、MMP-9蛋白在Newly diagnosed和(progressive disease,clinical relapse,and relapse from CR)MM患者中的平均表达水平明显高于(s CR及CR、VGPR、PR、SD)MM患者中的平均表达水平,经统计学分析,差异显著(P<0.01),与对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。5我们按照多发性骨髓瘤的患者是否伴有髓外浸润,将所有的多发性骨髓瘤患者分为两组。把12例III期MM患者中4例无髓外浸润的MM患者和8例伴髓外浸润的MM患者检测HOXB7蛋白水平,平均表达水平分别为(0.265±0.085)和(0.389±0.051),分别与对照组比较,差异显著,有统计学意义,二者之间比较,有明显差异(P<0.05)。WNT5A蛋白在无髓外浸润的MM患者中的平均蛋白水平为(0.441±0.075),伴髓外浸润的MM患者的WNT5A蛋白平均表达水平(0.673±0.0.185),分别与对照组比较,差异显著,有统计学意义,二者之间比较,有明显差异(P<0.01)。二者经过统计学分析显示(P<0.01),差异显著。6免疫组化染色HOXB7、VEGFA、β-catenin、WNT5a蛋白(1)免疫组化染色HOXB7蛋白结果:在I+II期患者中,有1例显示低表达,阳性率为5%,有2例高表达,阳性率为10%,在III期患者中,有5例呈现低表达水平,10例患者为高表达,阳性率分别为,17.9%,35.7%,两组MM患者经统计学分析有明显差异,(P<0.01)。III期MM患者的阳性率明显高于I+II期患者。在20例对照组中病例中有1例表达阳性,阳性率为5%,与对照组比较存在明显差异(P<0.05)。(2)免疫组化染色VEGFA蛋白结果:在I+II期患者中,有3例显示低表达,阳性率为14.2%,有4例高表达,阳性率为16%,在III期患者中,有7例呈现低表达水平,11例患者为高表达,阳性率分别为,25%,39.3%,两组MM患者经统计学分析有明显差异,(P<0.05)。III期MM患者的阳性率明显高于I+II期患者。在20例对照组中病例中有2例表达阳性,阳性率为10%,与对照组比较存在明显差异(P<0.05)。(3)免疫组化染色β-catenin蛋白结果:在I+II期患者中,有1例显示低表达,阳性率为5%,没有高表达,阳性率为0%,在III期患者中,有3例呈现低表达水平,5例患者为高表达,阳性率分别为10.7%,17.9%,两组MM患者经统计学分析有明显差异,(P<0.01)。III期MM患者的阳性率明显高于I+II期患者。对照组中无阳性表达,与对照组比较存在明显差异(P<0.05)。(4)免疫组化染色WNT5a蛋白结果:在I+II期患者中,有3例显示低表达,阳性率为14.2%,高表达患者有4例,阳性率为16%,在III期患者中,有7例呈现低表达水平,11例患者为高表达,阳性率分别为25%,39.3%,两组MM患者经统计学分析有明显差异,(P<0.01)。III期MM患者的阳性率明显高于I+II期患者。对照组中2例阳性表达,与对照组比较存在明显差异(P<0.05)。应用Pearson相关分析结果显示,HOXB7蛋白与WNT5A蛋白呈正相关,HOXB7蛋白与VEGFA蛋白呈正相关。7用ELISA的方法检测骨髓上清液在所有MM患者中,检测骨髓上清中IL-6、VEGF、MMP-2、MMP-9Cyclin D1、β-catenin蛋白含量,结果显示蛋白平均含量明显高于对照组,两者进行统计学分析,差异显著(P<0.05)。初治与复发进展MM患者IL-6蛋白含量明显高于病情稳定MM患者,进行统计学分析显示差异显著(P<0.05);结论:HOXB7基因及蛋白与WNT5a基因与蛋白在多发性骨髓瘤患者的不同分期中表达水平不同,III期的MM患者的表达较高。初治MM患者、复发及病情进展MM患者的表达水平与病情稳定患者比较有差异,有统计学意义(P<0.01)。二者在在髓外浸润的患者中表达高于无髓外浸润的MM患者,考虑MM患者中如果存在HOXB7与WNT5a表达,可能容易出现髓外浸润或者进展,故其表达水平可能与MM患者疾病的进展有关,并促进血管新生及髓外浸润。此外在高表达的HOXB7与WNT5a的患者中,伴随其他促血管新生及促细胞增殖的相关指标的表达。第二部分转录因子HOXB7促进多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖及应用小干扰RNA后对RPMI8226细胞的影响目的:应用瞬时转染的方法,采用HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞,使HOXB7基因表达下降,进一步探讨HOXB7基因对RPMI8226细胞增殖影响的机制,明确HOXB7基因在RPMI8226细胞株中的作用。方法:采用瞬时转染的方法,把特异的HOXB7-si RNA进行转染至RPMI 8226细胞,抑制细胞内HOXB7基因的表达。应用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测HOXB7 m RNA水平以及WNT5A m RNA,MMP-2m RNA,MMP-9 m RNA,β-catenin m RNA表达水平变化。并采用Western Blot的方法检测上述蛋白水平。转染后使用MTT的方法检测小干扰RNA对细胞活力的影响;同时应用流式细胞仪检测小干扰RNA对细胞周期的影响;结果:1 HOXB7-si RNA在转染RPMI8226细胞株48h后,HOXB7 m RNA表达水平明显受到抑制,HOXB7-si RNA转染组的表达水平为0.329±0.047,negative control-si RNA转染组为0.985±0.136,HOXB7-si RNA转染组的表达水平分别与阴性对照组和空白对照相比,差异显著,有统计学意义(P<0.01)。2用Western blot法检测HOXB7蛋白表达水平,转染24小时,HOXB7-si RNA转染组的蛋白表达水平为0.068±0.002,negative control-si RNA转染组的蛋白表达水平为0.619±0.118,HOXB7-si RNA转染组的表达水平分别与阴性对照组和空白对照相比,存在明显差异,有统计学意义(P<0.01)。3 HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞后RPMI8226细胞增殖影响MTT法检测RPMI8226细胞转染后的生长情况。通过绘制生长曲线,细胞转染HOXB7-si RNA48h,细胞的生长抑制较明显,negative control-si RNA转染组和HOXB7-si RNA转染组OD 490值比较有统计学意义(P<0.01)。4 HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞后细胞周期的变化。细胞周期分析显示HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞48h后,细胞阻止于G2期,处于G0/G1期细胞比例降低,G2/M期和S期细胞比例升高,凋亡峰显示凋亡的细胞比例增加。5 HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞后48h,未转染组、阴性对照转染组、HOXB7-si RNA组,HOXB7 m RNA相对表达水平分别为1.058±0.341;1.128±0.315;0.142±0.045,negative control-si RNA组和HOXB7-si RNA组相比有统计学意义(P<0.01)。MMP-2 m RNA相对表达水平分别为2.606±0.521;1.858±0.186;0.882±0.353(P<0.01)。MMP-9 m RNA相对表达水平分别为1.896±0.653;1.025±0.276;0.457±0.068;(P<0.05)。WNT5a m RNA相对表达水平分别为:1.016±0.195;1.002±0.206;0.507±0.026(P<0.01)。β-catenin m RNA相对表达水平分别1.012±0.205;1.006±0.179;0.682±0.351(P<0.01)。negative control-si RNA和HOXB7-si RNA二组相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)6 HOXB7-si RNA转染RPMI8226细胞后48h,未转染组、NS-si RNA组、HOXB7si RNA组,HOXB7蛋白相对表达水平分别为0.858±0.204,0.619±0.118和0.068±0.021,negative control-si RNA组与HOXB7-si RNA组相比有显著性差异(P<0.01)。MMP-2蛋白相对表达水平分别为1.018±0.216;0.734±0.159;0.283±0.114(P<0.01)。MMP-9蛋白相对表达水平分别为1.236±0.253;1.022±0.259;0.453±0.098;(P<0.05)。WNT5a蛋白相对表达水平分别为:1.016±0.129;0.947±0.221;0.207±0.028(P<0.01)。β-catenin蛋白相对表达水平分别1.154±0.205;1.006±0.179;0.682±0.351(P<0.01)negative control-si RNA和HOXB7-si RNA二组相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论:通过小干扰RNA瞬时转染HOXB7基因后,明显抑制RPMI8226细胞增殖,而瘤细胞凋亡增加,HOXB7表达水平降低后,WNT5A,MMP-2,MMP-9,β-catenin的表达也降低,可能与HOXB7表达水平降低,并进一步引起凋亡相关基因分子以及是否与WNT信号转导通路信号分子异常有关。第三部分人参皂苷Rg3(Rg3)抑制RPMI8226细胞株和U266细胞株增殖的研究目的:研究人参皂苷Rg3对RPMI8226细胞株的增殖影响,并为临床治疗多发性骨髓瘤提供理论证据,并阐述人参皂苷Rg3发挥抑制多发性骨髓瘤细胞的致病机制。方法:应用CCK-8的方法检测人参皂苷Rg3对RPMI8226细胞株和U266细胞株增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测人参皂苷Rg3对细胞周期分布;荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western Blot的方法,检测HOXB7m RNA,bcl-2 m RNA,bax m RNA,caspase-9 m RNA,,caspase-8m RNA和caspase-3 m RNA及蛋白水平的变化结果:1 CCK-8的方法检测人参皂苷Rg3对人类多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制的影响。人参皂苷Rg3对U266细胞株和RPMI8226细胞株的抑制作用存在时间-剂量-依赖性,人参皂苷Rg3在80μg/ml作用于U266细胞48h后,达到最大抑制水平。在一半最大抑制浓度(IC50)值为47.5 mg/mll。人参皂苷Rg3在RPMI8226(IC50=36.8μg/ml)细胞株中比U266细胞有更强的细胞增殖抑制作用。2流式细胞仪检测人参皂苷Rg3对细胞周期的影响。用20、40和80μg/ml的Rg3分别处理U266细胞和RPMI8226细胞株,结果显示在G1期细胞群百分比增加,而S期的细胞群比例下降。然而,Rg3对G2/M期没有影响。3 Western Blot分析显示经过Rg3处理U266细胞后,HOXB7蛋白的表达有所降低,bcl-2蛋白的表达有所降低,bax蛋白的表达有所升高,并降低了bcl-2/bax的比率。同时检测细胞凋亡-相关的蛋白质。Western Blot分析显示Rg3增加了caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白表达。结论:人参皂苷Rg3能够明显抑制U266、RPMI8226的细胞活性与增殖作用,出现有时间-剂量-依赖性。降低了HOXB7的水平,同时增加了凋亡蛋白的表达,并且可能通过调节细胞周期蛋白-依赖激酶途径导致细胞周期阻滞在G1期。考虑Rg3可能促进多发性骨髓瘤细胞的凋亡,使Bcl-2/Bax蛋白的平衡失调,故Rg3能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡,可以作为有效的治疗多发性骨髓瘤的药物。