【摘 要】
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利用特异性引物,通过PCR技术从三角褐指藻叶绿体基因组中获得rns-trnI、trnA-rnl作为遗传转化的同源重组序列,并分别从质粒pLysS和质粒pBI121-GFP中获得氯霉素乙酰转移酶(CAT
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利用特异性引物,通过PCR技术从三角褐指藻叶绿体基因组中获得rns-trnI、trnA-rnl作为遗传转化的同源重组序列,并分别从质粒pLysS和质粒pBI121-GFP中获得氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达盒和绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒,以CAT基因作为筛选标记,以GFP基因作为报告基因；以TA克隆载体pMD19-T为基础,通过限制性内切酶酶切及T4 DNA连接酶连接的方法将CAT表达盒以及GFP表达盒连接到rns-trnI、trnA-rnl两个同源重组片段之间,构建得到含有报告基因GFP表达盒的三角褐指藻叶绿体表达载体pPtC-GFP;利用电穿孔技术将载体导入三角褐指藻叶绿体中；通过氯霉素筛选获得阳性藻株,将阳性藻株扩大培养,通过PCR扩增外源基因CAT及激光扫描共聚焦显微镜检验GFP基因的表达。克隆得到同源重组片段rns-trnI、trnA-rnl,氯霉素抗性基因(CAT)表达盒及绿色荧光蛋白基因(GFP)表达盒,测序后证实是所需要的目的片段；通过一些列的限制性内切酶酶切验证确定4个载体元件成功连接到载体pMD19-T的多克隆位点上；电穿孔后的三角褐指藻分别通过200μg ml-1、300μgm1-1和400μg ml-1氯霉素筛选后,在固体f/2培养基上长出了清晰可见的藻苔；提取阳性藻株总DNA进行CAT基因扩增,可扩增出目的大小条带,测序后证实是CAT基因；在激光扫描共聚焦显微镜下观察阳性藻细胞,排除了藻自身叶绿体荧光干扰后,可清晰看到GFP发出的绿色荧光,表明三角褐指藻叶绿体遗传转化体系已经成功建立。
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