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第一部分:目的:检测富亮氨酸 α2 糖蛋白 1(leucine-rich-α-2-glycoprotein1,LRG1)在头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表达水平,探讨LRG1与HNSCC患者临床病理特征之间的关系。方法:免疫组化和Western blotting检测LRG1在HNSCC组织和正常对照组织中的表达。肿瘤组织样本按临床病理特征进行分类,比较LRG1表达的差异。ELISA检测HNSCC患者和正常对照血清LRG1的浓度,比较肿瘤在不同部位、不同临床分期时血清LRG1浓度差异。ROC曲线分析血清LRG1诊断HNSCC的能力。结果:正常组织和肿瘤组织LRG1免疫组化染色CES得分分别1.82±0.60、4.34±2.89。两组有明显统计学差异(P<0.01)。随着肿瘤体积增大,LRG1在肿瘤组织中表达升高(P<0.05)。但是T3期和T4期无明显统计学差异。随着恶性程度升高,LRG1表达也明显升高(P<0.05),但是Grade 2和Grade 3无明显统计学差异。LRGI在不同年龄、不同性别、肿瘤不同位置、不同N分期中并无明显统计学差异(所有P>0.05)。在早期(Ⅰ～Ⅱ期)和进展期(Ⅲ～Ⅳ期)HNSCC中LRG1的表达同样无明显统计学差异(P>0.05)。HNSCC患者血清LRG1平均浓度为62.4 μg/ml,而正常对照为42.9 μg/ml,高出0.5倍,有明显统计学差异。肿瘤按部位、按原发和复发、按临床分期来分类,血清LRG1浓度无明显统计学差异(所有P>0.05)。当设定血清CLRG1=60.66 μg/ml为诊断临界点时,诊断HNSCC、LSCC、早晚期HNSCC的特异度高(≥93.8%),敏感度不高(46.2%～71.4%之间)。3/4的肿瘤组织LRG1呈现高表达(P<0.05)。结论:HNSCC中LRG1表达升高。随着HNSCC的恶性程度升高和体积增大,LRG1表达逐渐上升,说明LRG1参与调控肿瘤的发生和进展。同时,血清LRG1的测定对诊断HNSCC具有一定的临床意义。第二部分:目的:探讨LRG1对HNSCC细胞生长的影响及分子机制。方法:Western blotting检测不同HNSCC细胞系LRG1的表达。利用RNAi技术沉默LRG1基因,利用慢病毒载体质粒建立LRG1稳定过表达HNSCC细胞系。qRT-PCR和Western blotting筛选有效的LRG1 siRNA序列。CCK-8实验检测CAL-27细胞在转染siLRG1后细胞增殖活力。克隆形成实验检测HEp-2细胞感染LRG1慢病毒过表达载体后克隆形成能力。Western blotting检测HNSCC细胞LRG1基因被调控后细胞周期、促凋亡和抗凋亡、自噬相关蛋白的变化。结果:在5种HNSCC细胞系中,CAL-27细胞LRG1表达相对较高,SCC-9、HEp-2、FaDu细胞中LRG1表达相对较低。siRNA-2为特异性沉默LRG1基因序列。成功建立LRG1稳定过表达HNSCC细胞系。HEp-2细胞LRG1过表达后,其克隆形成能力优于Ad.GFP组(P<0.01),抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达上升(P<0.01)。CAL-27细胞LRG1基因沉默后,其增殖能力小于对照组(Control组、NC组)(P<0.01),cyclin E2表达下降(P<0.05),促凋亡相关蛋白Bik表达上升(P<0.05)。自噬相关蛋白LC3A/B、Beclin1表达上升(P<0.05)。结论:LRG1正向调控HNSCC细胞的生长,与周期蛋白cyclin E2、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bik以及自噬相关蛋白Beclin1、LC3A/B有关。第三部分:目的:探讨LRG1对HNSCC血管生成的影响及分子机制。方法:划痕实验和Western blotting分别检测外源性重组蛋白rLRGl对HUVEC、HNSCC细胞迁移的影响及血管生成相关蛋白水平的变化,动脉环发芽实验检测rLRGl对血管生成的影响。划痕实验、Transwell迁移实验、Matrigel胶管腔形成实验、动脉环发芽实验检测HNSCC细胞LRG1基因过表达后血管生成能力。GEO数据库分析评估VEGF-A、HIF-1α、TGF-β1和TAp73在HNSCC中的表达情况。qRT-PCR、Western blotting检测HNSCC细胞LRG1基因受调控后血管生成相关蛋白的表达。结果:加入外源性rLRG1后,HUVEC迁移无明显变化(P>0.05),VEGFR2蛋白表达水平随rLRG1浓度上升而上升(P<0.05)。经过rLRG1处理的血管比对照组更容易出芽(P<0.01)。rLRG1可以促进HNSCC细胞FaDu、HEp-2迁移,使HEp-2细胞VEGF-A蛋白表达上升(P<0.05)而HGF蛋白表达下降(P<0.05)。HNSCC细胞LRG1过表达后,HUVEC迁移、管腔形成能力增强,新生血管易萌发。GSE58911数据库中VEGF-A、HIF-1α、TGF-β1在HNSCC中表达升高(P<0.05),TAp73表达稍高(P>0.05)。HNSCC细胞分别行LRG1基因过表达和siRNA沉默后,VEGF-A、HIF-1α、TGF-β1通路蛋白(TGF-β1、P-smad3、Smad3)表达分别出现了上升和下降(所有P<0.05)。FaDu和HEp-2细胞LRG1过表达后,TAp73 mRNA表达水平较Control组、Ad.GFP组均出现上升(P<0.01)。结论:LRG1可直接作用于内皮细胞促进血管生成,但并不是通过VEGF-A和VEGF-R2结合的方式,可能是直接激活VEGF-R2及其下游信号通路。HNSCC细胞LRG1促进HNSCC新生血管形成,可能是通过TGF-β1通路、HIF-1α通路、p73通路共同调节HNSCC细胞VEGF-A的表达。