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第一部分DOCK8缺陷状态下滤泡辅助T细胞产生IL-21调节Ig E的机制研究背景:高Ig E综合征(Hyper-Ig E syndrome,HIES)是一组常染色体遗传的原发性免疫缺陷病,其中常染色体隐性遗传(AR)的DOCK8免疫缺陷综合症(Dedicator of cytokinesis 8immunodeficiency syndrome,DIDS;OMIM 243700)是一种以特应性皮炎、反复、慢性皮肤病毒感染和呼吸道感染症状、血清lg E升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性免疫缺陷疾病。DOCK8基因定位于人类9号染色体p24.3,其编码的DOCK8蛋白可激活Rho-GTP酶,从而调节诸多细胞功能,尤其是肌动蛋白细胞骨架调控、影响细胞迁移活动。DOCK8缺陷患者罹患联合免疫缺陷,但B细胞介导的抗体缺陷最为突出,其中尤以Ig E水平急剧升高较为明显,目前机制未知。目的:分析中国的DOCK8缺陷综合征患儿临床表现及免疫功能,采用临床样本与DOCK8-KO小鼠模型探究DOCK8蛋白缺陷对Ig E水平的影响及其机制。方法:采用高通量测序及流式细胞术对疑似高Ig E综合征的患儿进行诊断,确立DOCK8缺陷诊断后进行淋巴细胞免疫功能评估,分析患儿及健康同龄对照外周血滤泡辅助T细胞数量和功能改变,以及其相关功能分子IL-21水平,实时荧光定量检测Bcl-6及Blimp-1 m RNA表达。运用TALEN技术建立DOCK8-KO小鼠模型并对其免疫功能进行评估,分析滤泡辅助T细胞数量功能改变,以及其相关功能分子ICOS、PD-1、Bcl-6及IL-21水平,对DOCK8-KO小鼠进行IL-21替代治疗并观察其对免疫功能的修复效应。进一步构建OVA诱导哮喘DOCK8-KO小鼠模型并对其进行IL-21补充治疗,解析其治疗机制。结果:1.7例DOCK8免疫缺陷患儿,2男5女,高Ig E综合征NIH评分均高于40分,表现为反复顽固的病毒感染,肺炎,血清Ig E异常增高和嗜酸性粒细胞增多等现象。针对DOCK8单基因的高通量测序分析显示7例患儿发生不同程度的大片段缺失突变、移码突变或错义突变,均为尚未报道过的新发突变。其中P1患儿为19-48号外显子杂合性大片段缺失并伴有移码突变(c.5842 del G,c 5843C>A p.A1948fs X1953),P2患儿11号外显子纯合性缺失,12-33号外显子杂合性缺失,P3-4患儿为移码突变(c.3152del G p.S1051fs X1093)和错义突变(c.5175G>C p.E1725D),P5患儿为2号外显子纯合性缺失,1号,3-39号外显子杂合性缺失,P6患儿为7号外显子纯合性缺失,8-10号外显子杂合性缺失,P7患儿为移码突变(c.1278-1279 del TG p.V427fs X435)。7例患儿完成流式细胞术及Western检测,外周血单个核细胞均无DOCK8蛋白表达。患儿外周血CD4+T细胞、记忆B细胞和记忆T细胞均有不同程度降低。T细胞删除环(TRECs)、淋巴细胞增殖水平和NK细胞的细胞毒杀伤功能均明显低于正常同龄儿童。外周血调节性B细胞水平低下,而调节性T细胞,CD4+T细胞产生细胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ水平均正常。DOCK8患儿滤泡辅助T细胞占CD4+T细胞比率与正常人相比无统计学差异,但绝对值却明显低于正常对照。尤其是Tfh细胞分泌的IL-21明显下降。2.(1)运用TALEN技术建立DOCK8-KO小鼠,DOCK8-KO小鼠较WT小鼠的血清Ig E、血液及脾脏中的Ig E+B细胞有升高趋势,并有统计学差异。DOCK8-KO小鼠的滤泡辅助T细胞相关功能分子出现不同程度的下降,其中细胞因子IL-21水平下降极为明显,Tfh细胞分化的主要调节转录因子Bcl-6,以及Tfh细胞的功能分子PD-1、ICOS水平均不同程度降低。(2)采用传统剂量四分之一的低剂量OVA成功诱导DOCK8-KO小鼠哮喘模型,模型小鼠出现明显的肺功能异常,血清Ig E水平升高,嗜酸性粒细胞增多等过敏特征。OVA诱导的DOCK8-KO及WT小鼠Ig E+B细胞水平均有升高现象,但前者升高的水平是后者的数倍,其中血清总Ig E及OVA特异性Ig E水平升高尤为明显。经OVA诱导的DOCK8-KO小鼠IL-21水平随之进一步下降,而经OVA诱导的WT小鼠则没有明显改变。另外,OVA诱导的DOCK8-KO小鼠脾脏记忆性Tfh细胞,Tfh细胞分化的主要调节转录因子Bcl-6,以及Tfh细胞的功能分子PD-1、ICOS均出现明显降低。3.(1)使用重组小鼠IL-21细胞因子(20ng/d×3-6天)对DOCK8-KO小鼠进行替代治疗,发现KO小鼠血清Ig E水平几乎能够回复到正常水平,脾脏Tfh细胞及其分化的主要调节转录因子Bcl-6,以及Tfh细胞的功能分子PD-1和ICOS均能不同程度的回升至接近正常水平,治疗效应十分明显。(2)采用IL-21治疗OVA诱导的小鼠模型,WT小鼠的Ig E水平虽有回复,但总体治疗效果不如DOCK8-KO小鼠明显。经OVA诱导的DOCK8-KO小鼠经过IL-21治疗其Ig E水平能够回复到正常水平,并且Tfh细胞及其主要调节转录因子Bcl-6,以及Tfh细胞的功能分子PD-1,ICOS均能不同程度的回升至正常水平。结论:DOCK8缺陷引起Tfh细胞发育分化障碍,IL-21分泌降低,可能是导致B细胞对过敏原反应失控,产生大量功能性Ig E的根本原因。第二部分IKKβ缺陷对NF-κB入核的影响背景:IKBKB基因突变是一种特殊的联合免疫缺陷病,以反复细菌、病毒、真菌感染为主要表现,大部分病人会出现不同程度鹅口疮、支气管炎及肺炎,并伴有慢性腹泻、生长发育迟缓、脑出血、癫痫、脐炎、脐带脱落延迟等现象。IKBKB基因定位于人类8号染色体p11.2,其编码的IKKβ蛋白是IκB kinase的亚单位之一,主要参与NF-κB通路激活过程,活化的IKK磷酸化IκBα(NF-κB的抑制剂),磷酸化的IκBα不断降解,使其对NF-κB的抑制功能减弱,后者则可以自由出入细胞核并激活参与炎症及免疫反应的各种基因。目的:分析一例IKBKB突变患儿临床表现、蛋白表达、基因突变及免疫功能。探讨395位点氨基酸磷酸化对NF-κB入核影响及通路功能的影响及机制。方法:患儿男,17岁,生后2月龄开始出现反复呼吸道感染,腹泻及低体重。采用高通量测序发现基因突变,并用一代测序验证,采用流式细胞术及免疫印迹法检测IKKβ蛋白。采用流式细胞术分析淋巴细胞功能,EMSA方法检测核内NF-κB水平。制备395位点定点变异细胞系,以去除该位点磷酸化,探讨其对IKKβ蛋白稳定性的影响机制。结果:高通量测序显示IKBKB基因发生错义突变(c.1183T>C,p.Y395H),为尚未报道的新发突变。一代测序验证确认为该位点突变,流式细胞术及免疫印迹法均未能检测到IKKβ蛋白表达。免疫功能评估中发现患儿记忆B细胞极度低下,调节性T细胞缺如,淋巴细胞增殖水平明显受损。调节性B细胞升高,而CD4+T细胞表达细胞因子IL-17、IL-4、IL-21及IFN-γ均处于正常下限,NK细胞的细胞毒杀伤功能及TCRVβ多样性正常。患儿细胞核内NF-κB蛋白较正常人明显降低,提示基因突变导致进入细胞核的NF-κB水平减少。进一步发现395位点突变导致磷酸化位点消失后IKKβ降解速率增快,蛋白稳定性下降。结论:确诊1例极为罕见的PID病例——IKBKB缺陷,为全球范围内报道的第10例患儿。IKKβ的395位点发生的错义突变为尚未报道过的新发突变。首次阐明该位点是IKKβ蛋白重要的磷酸化位点,由酪氨酸突变为组氨酸造成的氨基酸改变会导致磷酸化位点丢失,降解增快,从而最终影响NF-κB入核。