microRNAs (miRNAs)是一类大小约为18-23 nt的小分子非编码RNA,其发现被誉为2002年世界十大科技突破之首。miRNAs由具有发夹结构的70～90个碱基大小的单链niRNA前体(pre-miRNA)经Dicer加工产生而成,广泛存在于生物界中,自第一个miRNA分子在线虫中发现后,在动物、植物以及病毒中已经有24521个miRNAs分子被鉴定,在人体中niRNAs的种类也超过了2200种。miRNAs以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中,而且绝大部分定位于基因间隔区,其转录独立于其他的编码基因,并不参与蛋白质的翻译。miRNA主要通过降解靶mRNAs或抑制靶mRNAs编码蛋白质的翻译,从而沉默特定的靶基因,从而发挥生物学作用；某些miRNAs还能改变相应mRNAs的半衰期来调控基因的表达。miRNAs的序列也不是任意的,在很大的进化距离中具有保守性。通过生物信息学手段可以发现,人类约有1/3以上的蛋白编码基因受到miRNAs的调节。niRNAs通过调节目的蛋白的表达,在生物体的早期发育、信号传导、细胞死亡,细胞凋亡、细胞增殖等生理和病理过程中都发挥着重要的作用。单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1, HSV-1)感染眼部所引起的单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)可导致角膜溶解、新生血管形成、溃疡穿孔乃至全眼球炎等严重的病理改变。本病复发率高且严重损害视功能,是全球致盲率第一位的角膜病变1-3。尽管迄今为止,关于HSK的研究取得了一定的进展,对于这种疾病的发生、发展、转归及防治有了一定程度上的认识。但在这些领域还有很多未知的空白有待填补。越来越多的证据表明：miRNAs作为机体内各种生理及病理活动的关键调节因子,参与了固有免疫应答及适应性免疫应答。就宿主与病毒而言,miRNAs的调控既参与了宿主对自身的保护机制和对病毒的抑制,又参与了病原体对抗宿主免疫过程。那么,HSV-1感染引起HSK炎症反应早期是否影响了角膜组织miRNAs的表达?miRNAs是否参与HSK的炎症反应?作用机制又如何?上述问题目前国外研究尚少,国内均未见系统报道。有鉴于此,我们首先以HSV-1感染小鼠角膜,建立HSK炎症反应模型,并以此为研究对象,利用基因芯片等技术系统分析了HSV-1感染后角膜组织miRNA表达谱的改变情况,并且利用生物信息学技术分析差异miRNAs的作用；在此基础上,我们对表达变化最为明显的miRNA-155在HSK炎症反应中促炎作用的分子机制展开研究,评价了miRNA-155对HSK临床表现的影响。本课题拟通过对以上科学问题的探讨,一定程度上阐明HSK炎症反应的的非编码RNA机制,为后续的疾病治疗及药物开发提供理论和实验基础。第一部分HSV-1感染引起角膜组织microRNA表达谱变化及功能分析目的：(1)运用miRNA芯片法检测HSV-1感染后导致的HSK小鼠角膜组织与正常小鼠角膜组织的miRNA表达谱变化,初步筛选出差异miRNAs。(2)将芯片结果进行生物学验证,运用qRT-PCR确定HSK与正常小鼠角膜组织中表达差异的miRNAs。(3)运用生物信息学技术预测差异miRNAs的靶基因,分析差异靶基因的功能,构建MicroRNA-GO-Network,研究miRNAs调节的主要生物学功能,讨论其在HSK发病过程中的作用。方法：(1)C57BL/6小鼠共40只,构建小鼠HSK动物模型,随机分为2组：对照组20只,仅对该组小鼠行角膜“十”字划伤,接种病毒培养液；实验组20只,该组小鼠在给予“十”字划伤后,将Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)滴入结膜囊,按摩30s。划伤眼每日以0.5%庆大霉素眼液滴眼建立小鼠HSK模型。(2)获取实验组与对照组小鼠角膜组织,利用Affymetrix miRNA 3.0芯片分析二者miRNA表达谱系的差异,找出表达水平显著改变的miRNAs.(3)选取芯片结果中差异性表达明显(上调或下调超过2倍)的成熟miRNAs,运用qRT-PCR技术对miRNA芯片结果进行验证,确定HSK角膜组织中差异表达的miRNAs.(4)生物信息学技术预测差异miRNAs的靶基因,构建靶基因功能网络,确定差异miRNAs与炎症反应相关的主要功能。结果(1)裂隙灯观察术后小鼠,术后7天小鼠明显发病,角膜上皮见上皮完整性破坏,角膜混浊明显,新生血管形成。可见小鼠角膜“十”字划痕法建立的HSK的模型有很好的可操作性和重复性,模型成功率为90%,可以用于miRNA表达谱变化的研究。(2)基因芯片结果显示,共有34个miRNA出现差异性表达：mmu-miRs-5100,-21-3p,-133a-3p,-18a-5p,-150-5p,-155-5p,-133b-3p,-139-5p,-146a-5p,-206-3p,-124-3p,-300-3p,-5115,-5097,-1224-5p,-720,-712-5p,-342-3p,-223-3p,-714,-17-3p,-1934-3p,-204-5p,-3968,-21-5p,-3096b-5p,-200a-3p,-204-3p,-148a-3p, -181c-5p, -346-3p, -434-3p,-711,-762.其中15个miRNA出现差异性表达在2倍以上,其中mmu-miRs-223-3p,-155-5p,-21-3p,-150-5p,-18a-5p,-3096b-5p,-146a-5p,and -342-3p表达上调；mmu-miRs-434-3p,-124-3p,-204-5p,-133b-3p,-206-3p,and -133a-3p表达下调。(3)qRT-PCR证实,niRs-204-5p,-206-3p,-155-5p,-133a-3p,and -150-5p在HSK角膜组织中有明显差异性表达。(4)上述5个miRNAs共有125潜在靶点。92个上调的基因受到mmu-miRs-204-5p,-206-3p,及-133a-3p三个下调基因的调控；33个下调基因受到mmu-miRs-155-5p及-150-5p两个上调基因的调控。(5)miRNAs靶基因网络及功能分析显示,5种差异miRNAs靶基因共同具有的与炎症反应密切相关的功能为细胞增殖的负调控及细胞黏附。结论：(1)角膜“十”字划痕法建立的HSK的小鼠模型有很好的可操作性和重复性,可以用于miRNAs表达谱差异的研究。(2) miRNA芯片显示HSV-1感染造成的HSK角膜组织与对照组角膜组织中miRNAs表达谱有明显差异,34种miRNAs出现了表达变化。(3) qRT-PCR证实5种miRNA在HSK角膜组织中有明显差异性表达,差异的趋势与芯片结果相同。(4)表达差异的miRNA有多达125个潜在靶点。靶基因的共同的主要功能中,细胞增殖的负调控及细胞黏附,与炎症反应高度相关与炎症反应密切相关的功能为细胞增殖的负调控及细胞黏附。第二部分microRNA-155于单纯疱疹病毒性角膜炎炎症反应调控作用初探目的：(1)探索miRNA-155局部在体下调小鼠模型的建立方法。(2)探讨miRNA-155影响小鼠HSK炎症反应程度的分子学机制。(3)探索miRNA-155局部下调对小鼠HSK角膜炎症反应临床表现的影响。方法：(1)C57BL/6小鼠共30只,组1右眼前房内注射慢病毒,左眼注射等量NS；组2右眼角膜上皮划伤,载体慢病毒液浸润,左眼同样方法以NS对照；组3右眼前房注射空质粒病毒载体,左眼刮伤上皮,浸润等量空质粒病毒载体。建模后第3、5、7天裂隙灯下观察GFP于角膜部位的表达。于第7天取角膜,切片后荧光显微镜下观察GFP表达。(2)C57BL/6小鼠50只,10只“十”字划伤建立HSK模型,20只“十”字划伤建立HSK模型后角膜上皮划伤慢病毒浸润法转染miRNA-155下调质粒,构建miRNA-155局部下调HSK小鼠模型,20只同样方法建立阴性对照质粒转染HSK小鼠模型。建模后7天,选取GFP表达占角膜面积20%以上的HSK小鼠角膜,qRT-PCR法检测IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IFN-y, TNF-a, CXCL1的表达水平(3)C57BL/6小鼠50只,按照上述方法建立HSK小鼠10只、miRNA-155下调HSK及阴性对照质粒转染HSK模型各20只。建模后7天,选取GFP角膜表达占角膜面积20%以上的HSK小鼠,双盲法采用Heiligenhaus等[1]及Foster等[2]介绍的标准对小鼠HSK临床表现进行评估。结果(1)裂隙灯观察角膜划伤后局部浸润慢病毒的小鼠角膜,术后3天可见明显GFP表达,5天表达增多；7天时GFP面积最大,强度增强；前房注射法未见GFP荧光表达。荧光显微镜观察显示慢病毒主要感染部位为角膜上皮及浅基质可以用于miRNA下调的研究。(2) qRT-PCR结果显示,HSK组,miRNA-155下调HSK,及空质粒转染HSK组IL-17及CXCL1表达差异有明显统计学意义。(3)临床表现评分显示,HSK组,：niRNA-155下调HSK,及空质粒转染HSK组于感染后3天,5天及7天角膜上皮损伤,角膜混浊及新生血管程度差异均无明显统计学意义。结论：(1)角膜局部划伤慢病毒浸润后,载体可转染小鼠角膜上皮及浅基质层,有较好的可操作性,可以用于miRNA功能的研究。(2) miRNA-155下调可减少角膜IL-17及CXCL1的表达。HSK发病过程中,miRNA-155可能通过影响炎症因子的表达水平调控炎症反应的发生及其严重程度。(3)基于现有的模型样本量,miRNA-155局部下调对HSK临床表现严重程度无明显影响。