DNA甲基化（DNA methylation）是指在甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMT）的催化下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团,形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化修饰改变了DNA的物理结构,阻止DNA结合蛋白在转录过程与DNA链的结合,从而调控基因表达,是重要的表观遗传调节方式之一。DNA甲基化对营养高度敏感,食物中的叶酸（folic acid,FA）、维生素B₁₂、甜菜碱（betaine）、甲硫氨酸（methionine）和胆碱（choline）等成分是重要的甲基供体,通过一碳单位代谢途径直接或间接影响DNA甲基化。大量的流行病学统计数据和动物研究表明围孕期甲基供体营养素的不足或过剩,可通过影响DNA甲基化等表观遗传修饰,改变部分关键基因的表达,从而引起子代多种神经发育、行为和神经认知功能等表型的改变。但上述的研究几乎都集中在母体因素,缺乏对父系甲基供体摄取对子代影响的考察。已有研究证据表明,精子细胞的表观基因组会受到父亲环境暴露因素的影响,从而引发子代表型的改变,所以为了探讨父亲高甲基化饮食暴露对子代小鼠神经系统功能的影响,我们开展了本研究。在交配前6周给予C57BL/6J雄鼠含高甲基化供体营养素的3S ZM饮食（methyl donor-rich diet,MD）,对照组雄鼠为正常标准的Teklad Global 18%蛋白啮齿动物饲养饮食（control diet,CD）,两组均与正常饮食的129S6/SvEv母鼠同笼,然后对两组的子一代（F1）小鼠神经功能进行研究。行为学上,我们利用Morris水迷宫、场景条件恐惧、转棒、抓握力、旷场以及震惊反射等实验,对F1小鼠的感觉、运动、情绪以及学习记忆等神经系统功能进行了测试。细胞和环路机制的探究中,进行了F1小鼠安静和活动状态下的海马区在体脑电图记录,监测与学习记忆相关的θ振荡波（theta oscillations）;离体海马脑片schaffert纤维至CA1锥体细胞场电位记录和全细胞膜片钳记录并分析了F1小鼠海马神经环路的突触传递可塑性、神经元的内在兴奋性以及突触的自发活动;在基因水平的检测,由合作实验室利用基于微阵列的基因表达分析、焦磷酸测序及DNA甲基化免疫共沉淀等技术手段分析两组小鼠海马组织全基因组基因表达改变及甲基化情况,以期了解高甲基化供体饮食对子代鼠甲基化的影响,寻找可能被调控的基因。我们的第一部分研究结果如下:1.行为学测试:Morris水迷宫第7天的空间探索实验结果显示对照饮食的CD F1鼠在目标象限的探索时间和平台穿梭次数与其他象限有明显区别,而MD F1鼠不能区分目标象限和右侧象限,但两组小鼠的潜伏期、平均游泳速度和总距离无明显差别;在场景条件恐惧测试中,MD F1小鼠僵直时间减少;而转棒、旷场、热板等与感觉、运动和情感相关的行为学测试中两组小鼠无明显差别。2.在体海马脑电记录:海马θ振荡热图及统计显示,同对照CD F1小鼠相比,MD F1小鼠的θ振荡波明显减少。3.场电位记录:输入-输出（input-ouput）反应和双脉冲易化（paired-pulse facilitation,PPF）记录显示,MD F1小鼠同对照CD F1小鼠的基本突触传递无明显差异,而MD F1小鼠在1×100Hz高频刺激后0¹0min的早期长时程增强（long-term potentiation,LTP）障碍。4.膜片钳记录:电流钳记录结果提示同对照CD F1小鼠相比,MD F1小鼠内在兴奋性下降:快速后超级化电位（fast after-hyperpolarization potential,fAHP）增大、动作电位（action potential,AP）半宽减小、产生AP个数减少以及AP的潜伏期增加,但两组之间的静息电位,输入阻抗,AP幅度和AP阈值没有显著差异;电压钳记录显示,MD F1小鼠自发抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory post-synaptic currents,sIPSC）频率下降,而幅度无明显变化,自发和微小兴奋性突触后电流的频率和幅度亦无明显改变。5.海马基因组甲基化检测显示同CD F1小鼠相比,MD F1小鼠的Kcnmb2和Mat2a（编码甲硫氨酸腺苷转移酶Ⅱa）等基因表达下调;甲基化检测显示Kcnmb2启动子区域甲基化明显增加。Kcnmb2是大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca²⁺-and voltage-activated K⁺channels,BK)重要的负性调节亚基β₂的编码基因,而BK通道又是研究比较明确的与神经元内在兴奋性,突触可塑性以及学习记忆密切相关的调节因素之一。结合MD F1小鼠在上述电生理测试尤其是内在兴奋性记录中的改变,我们考虑MD F1小鼠海马依赖的学习记忆障碍是否主要是由于Kcnmb2表达的减少而引起的呢?所以在第二部分实验中我们采用带荧光标记的腺相关病毒AAV₁-hSYN1-GFP在子代鼠背侧海马过表达Kcnmb2,2周后采用荧光检测AAV病毒在海马区表达范围和程度;免疫荧光检测KCNMB2表达情况,并且进一步采用定量PCR对病毒表达进行定量分析。4周后进行行为学、场电位与膜片钳检测,结果显示:1.共聚焦荧光显微镜检测发现腺相关病毒AAV₁-hSYN1-GFP能够很好的转染海马背侧CA1区的神经元,免疫荧光检测显示CA1区有KCNMB2蛋白的表达,表达部位和注射部位重合;而且定量PCR结果也能够说明过表达Kcnmb2后,表达量显著升高。2.水迷宫第7天空间探索实验:目标象限探索时间和平台穿梭次数结果显示,过表达对照病毒的MD F1小鼠仍然不能够区分目标象限与右侧象限,与基态MD F1小鼠表现一致,而过表达Kcnmb2的MD F1小鼠空间记忆障碍得到改善;我们同时发现过表达Kcnmb2基因的CD F1小鼠未出现空间记忆的明显改变。3.场电位记录结果显示:过表达对照病毒的MD F1小鼠与基态MD F1小鼠一样存在早期LTP的形成障碍;而过表达Kcnmb2基因的MD F1小鼠与CD F1小鼠的LTP形成能力无明显差别。4.膜片钳电流钳结果显示:过表达对照病毒的MD F1小鼠同过表达对照病毒的CD F1小鼠相比,fAHP增大,半宽减小,AP发放数目减少,与基态MD F1内在兴奋性改变一致;而过表达Kcnmb2基因后,MD F1小鼠内在兴奋性与过表达Kcnmb2 CD F1小鼠以及过表达对照病毒的CD F1小鼠无明显差别;电压钳结果与电流钳结果一致,过表达对照病毒的MD F1小鼠仍然存在自发抑制性突触后电流频率的异常,而过表达Kcnmb2可以纠正MD F1小鼠自发抑制性突触后电流频率异常,与过表达Kcnmb2的CD F1小鼠自发抑制性突触后电流频率无明显差别。综合以上的实验结果,我们推测父系小鼠的高甲基化饮食可通过DNA甲基化等表观遗传修饰的改变导致子代小鼠出现海马依赖的学习记忆障碍,可能的靶点之一为Kcnmb2基因,Kcnmb2启动子区域的甲基化修饰异常增加而表达受抑。因为Kcnmb2基因编码BK通道的β₂亚基,其表达降低导致BK通道因抑制性因素减少而活性增强,最终导致MD F1小鼠海马CA1区锥体神经元内在兴奋性降低、突触可塑性的异常等而出现海马依赖的学习记忆障碍。本研究提示父系高甲基化供体饮食可以对子代小鼠认知行为等神经系统功能产生代际间的影响,为进一步细化叶酸等甲基供体摄入标准及合理应用提供参考,从而有助于制定更谨慎安全的公共卫生政策。本研究同时证明Kcnmb2基因对神经元的内在兴奋性和突触可塑性以及学习记忆等神经生理有调控作用,不仅丰富了我们对学习记忆细胞分子机制的认识,而且为已报道诸如自闭症、阿尔兹海默症、抑郁症及精神分裂症等与BK功能相关、与表观遗传调控异常相关的伴认知障碍的精神疾病的治疗,提供了可能的靶向调控基因。