背景和研究目标:消除疟疾的核心策略之一是通过发现和管理所有疟原虫感染者,以达到清点拔源、阻断传播的目的。疟疾无症状感染者被认为是“传染源储存库”,在疟疾传播和传染源管理中具有重要意义。中缅边境作为我国消除疟疾的重点难点地区,边境两侧疟疾发病和无症状感染水平在消除疟疾过程中逐渐引起关注,但对无症状感染者流行病学特征、带虫持续时间以及分子机制缺少系统研究。本课题围绕中缅边境疟疾无症状感染水平、流行病学特征和影响因素开展研究,为该地区实施消除疟疾“线索追踪、清点拔源”核心策略和巩固消除疟疾成果提供科学依据。技术路线:本文分三部分开展研究,首先比较镜检、荧光PCR和超敏PCR等当前用于疟原虫检测的常用方法对无症状感染者的检测敏感性和一致性,从中优选出对无症状感染者最敏感的检测方法,在中缅边境两侧选点开展横断面研究,了解边境两侧疟疾无症状感染水平(第一部分);现场收集调查对象的基本信息和职业、人蚊接触和疟疾罹患史等与疟原虫感染有关信息,进行单因素与多因素分析,并对个体免疫相关基因位点和疟原虫抗性分子多态性进行检测,以阐明无症状感染者的流行病学特征及其影响因素(第二部分);同时对调查发现的疟疾无症状感染者进行队列研究,探讨无症状感染持续时间、感染状态动态变化特征及其可能的影响因素(第三部分)。方法:利用中缅边境地区既往现场采集的居民血样,比较显微镜检测、超敏PCR法与荧光PCR法对无症状感染的检出率和一致性,遴选无症状感染者筛查最敏感的方法,在云南中缅边境两侧的4个村寨/安置点开展疟疾无症状感染水平横断面研究。收集调查对象的年龄、性别、职业、外出特征、蚊媒暴露、近期疟疾罹患史等资料,应用单因素和多因素分析方法,阐明无症状感染者的人群流行病学特征及其主要影响因素。在分子水平对调查发现的无症状感染者抗性分子标记多态性进行分析,运用飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分型技术对免疫相关分子 TLR SNP 位点(TLR9 T1486C、TLR9 G1174A、TLR5 R392Stop)进行检测,分析TLR SNP位点的等位基因和基因型多态性对无症状感染的影响。同时对无症状感染者进行队列研究,运用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型分析无症状带虫持续时间、感染状态变化特征及其影响因素。结果:超敏PCR法对无症状感染者的检出率最高,387份样本中检出38例阳性,检出率达9.82%;荧光PCR法检出阳性13例,检出率3.36%;镜检仅检出6例,检出率仅为1.55%。超敏PCR法与另两种方法的一致性较好,与荧光PCR法和显微镜检测的观察一致性分别为93.54%和91.73%,且荧光PCR法和显微镜检测发现的阳性者,超敏PCR法均能检出,表明超敏PCR法对无症状感染者的检出最为敏感。采用超敏PCR法在中缅边境两侧4个村寨/安置点(境外3个,境内1个)对共1147个居民开展无症状感染水平的横断面研究,结果发现该地区无症状感染率为8.81%,均为间日疟。境外调查点的无症状感染率(9.60%)显著高于境内(3.40%)(χ2=6.13,P=0.01)。检测分析不同疟疾发病率年份的人群血样,发现境内无症状感染水平因发病率不同有显著差异,2014年境内调查点疟疾发病率为0.40%,其无症状感染率为9.75%,而2019年同一调查点疟疾发病率为0%,无症状感染率为3.40%(χ2=5.54,P=0.02)。境外不同采样年份虽然疟疾发病率有下降,但无症状感染水平无明显变化,分别为10.00%和9.60%。流行病学特征分析发现,男性无症状感染率(10.91%)明显高于女性(7.21%)(χ2=4.78,P=0.03),不同年龄无症状感染水平亦有显著差异(χ2=14.89,P=0.02),51～60岁组最高为17.57%。男性41～50岁年龄组无症状感染率最高,为22.58%;而女性51-60岁最高,为15.69%,另女性11～20岁年龄组亦较高,达8.77%。单因素和多因素分析表明,性别、主要生活/工作场所、每周最远外出距离为无症状感染的影响因素,即男性(OR=1.73,95%CI=1.05～2.85)、生活/工作场所主要为室外(OR=1.96,95%CI=1.05～3.65)、每周外出距离较远(与≤1公里相比,每周最远距离1～5公里:OR=2.76,95%CI=1.55～4.92;每周最远距离>5公里:OR=2.88,95%CI=1.21～6.87)是无症状感染的主要危险因素。TLR SNP位点等位基因多态性分析发现,与AA基因型相比,TLR9 T1486C位点AG基因型是无症状感染的保护因素(校正OR=0.45,95%CI-0.24～0.84)。抗性分子标记多态性分析显示,间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性明显,包括:Pvdhfr突变型占100%、Pvdhps突变型占40%、Pvmdr1突变型占100%、Pvcrt-o突变型占40%;恶性疟无症状感染者Pfcrt亦为突变型。间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性分布与确诊病例无明显差别。队列研究表明,中缅边境地区间日疟无症状感染者发展至有症状的比例为3.85%(3/78)。Kaplan-Meier法分析显示,无症状感染持续时间平均(中位数)为8周,感染状态变化模式多样,24.36%的随访者表现为持续阳性、20.51%持续1～4次阳性后转阴、32.05%表现为间断性阳性、11.54%呈现一过性阳性。Cox比例风险回归模型分析表明,年龄、外出频率、森林/林区暴露史是影响无症状感染持续时间的重要因素,其中相较于≤20岁组,年龄>20岁无症状感染者从阳性转阴的概率更高,风险比HR为2.11(95%CI=1.12～3.97);与不外出者相比,经常外出者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.39(95%CI=0.16～0.96);与无森林/林区暴露者相比,有暴露史者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.51(95%CI=0.27～0.94)。结论:中缅边境地区疟疾无症状感染水平较高,发病较高的缅甸一侧其无症状感染水平显著高于发病较低的云南一侧。流行病学特征表现为男性和51～60岁是高发人群,男、女性无症状感染的年龄分布不同。性别、主要生活/工作场所、每周较远距离外出是无症状感染率的主要影响因素,上述流行病学特征显示无症状感染和疟疾显性发病一样与人蚊接触关系紧密。队列研究发现,近四分之一无症状感染者持续带虫,持续时间平均(中位数)达8周,年龄、外出频率和森林/林区暴露史是无症状感染持续时间的主要影响因素。