胶质瘤(Glioma)是一种常见的具有神经胶质细胞特征的恶性脑肿瘤;多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是原发性中枢神经系统肿瘤中恶性程度最高的一类脑胶质瘤。胶质瘤具有浸润性生长的特性,手术无法彻底切除肿瘤,通常采用手术切除、化疗和放疗进行联合治疗,即使经过最大限度的治疗,肿瘤仍会复发,诊断后患者平均生存时间为12-15个月。脑胶质瘤干细胞(Glioma Stem Cell,GSC)具有自我更新和多能性分化等干细胞的特征,GSC对放疗和化疗不敏感,是肿瘤发生、放化疗抵抗和复发的关键因素。GSC积极改造肿瘤微环境,维持自身存活。大多数常规的抗肿瘤治疗靶向增殖的细胞,为了有效的清除GSC,靶向其与肿瘤微环境的相互作用也尤为重要。药物直接靶向肿瘤微环境中的分泌蛋白,可以避免药物在肿瘤细胞内的运输。寻找能作为治疗脑胶质瘤的靶点的分泌蛋白具有重要意义。SWATH-MS是一种先进的非标记定量方法,采用数据非依赖采集模式和靶向数据提取策略,能够用于低丰度蛋白的定量检测,具有定量覆盖率高、定量准确度高、样品前处理简单等优点。我们应用SWATH-MS技术对GSC和其对应的NSTC培养上清进行了定量分析,总共定量到647种蛋白质,85种蛋白质在GSC培养上清中显著变化,其中39种蛋白质在GSC培养上清中含量高,46种蛋白质在GSC培养上清中含量低。利用脑肿瘤数据库对所获得的一系列差异蛋白进行临床相关性分析。我们发现相对于正常脑组织,Pirin在GBM患者中高表达;在预后相关性分析中,高表达Pirin的脑胶质瘤患者的预后明显较差。我们确定Pirin为进一步研究对象,研究Pirin在GSC中的功能以及作用机制。通过蛋白印迹法(Western Blot)和实时定量PCR(Real-time PCR)检测Pirin在GSC分化前后表达水平的变化,结果表明,在蛋白质水平和mRNA水平,Pirin均在GSC中特异性高表达。用血清诱导GSC分化成NSTC的过程中,Pirin的蛋白质表达水平随着分化时间延长而逐渐下降。为了进一步研究Pirin在GSC中是否发挥特异的功能,我们构建了Pirin shRNA稳定干涉质粒,采用磷酸钙转染法进行慢病毒包装,通过慢病毒感染GSC稳定敲低Pirin的表达。结果显示敲低Pirin的表达可显著抑制GSC形成肿瘤细胞球的能力和细胞活力,对NSTC的细胞活力没有明显影响。以化疗药替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)为阳性对照,Pirin特异性的小分子抑制剂TPh A能够显著的抑制GSC的细胞活力。综上所述,我们建立了针对脑胶质瘤细胞分泌体系的定量蛋白质组学分析方法,发现Pirin在GSC中高表达,高表达Pirin的脑胶质瘤患者的预后明显较差。敲低Pirin的表达能够显著抑制GSC的自我更新能力和增殖能力,对NSTC的增殖能力没有明显影响,这提示Pirin对GSC的调控功能具有特异性。下一步我们将进行裸鼠颅内原位成瘤实验,明确敲低Pirin的表达对裸鼠生存周期是否有影响。为了深入探究Pirin在GSC中的作用机制,我们已经构建了Pirin-Flag外源稳定过表达质粒,Western blot结果显示,Pirin-Flag质粒在GSC中能够正确表达,提示已成功构建外源过表达Pirin-Flag的GSC细胞系。接下来我们将通过免疫共沉淀实验和质谱分析寻找在GSC中与Pirin相互作用的蛋白质,并研究其相互作用的功能和机制,从而揭示Pirin对GSC的特异性调控机制,希望能为脑胶质瘤患者的临床治疗提供新的思路。