论文部分内容阅读
目的通过沉默乳腺癌细胞MCF-7中的Mfn2（Mitochondria fusin-2）基因，观察其对细胞侵袭、迁移能力的影响，并探讨其作用机制是否与MMP-2（Matzixmetalloproteinase2）相关，为将Mfn2基因作为乳腺癌治疗的新靶点用于临床奠定理论基础。方法用Western blot方法比较弱侵袭力乳腺癌细胞MCF-7和强侵袭力乳腺癌细胞MDA-MB-231中Mfn2的表达水平。设计针对Mfn2基因的siRNA，利用转染试剂-脂质体Lipofectamine2000包裹Mfn2-siRNA，将其导入乳腺癌细胞MCF-7中，以沉默目的基因Mfn2（实验组），同时设立阴性对照组（转染无意义序列组）和空白对照组（未转染组）。用带荧光染料的阴性对照组摸索最佳转染条件。采用qRT-PCR（real-time fluorescent quantitative, PCR）方法在RNA水平上检测Mfn2基因沉默效果。分别用免疫细胞化学和Western blot方法检测Mfn2的表达水平。采用Transwell实验和划痕实验分析比较三组中MCF-7细胞的侵袭力和迁移力的异同。采用免疫细胞化学和Western blot法，在蛋白水平上检测三组细胞中MMP-2的表达量。结果弱侵袭力细胞MCF-7中Mfn2表达水平高于强侵袭力细胞MDA-MB-231，两组间有显著性差异（P＜0.05）。利用带荧光染料的阴性对照序列找到最佳转染条件，转染试剂为2μl的FAM-siRNA对应1μl的Lipofectamine2000，转染效率可高达85%；应用qRT-PCR法结果显示：实验组，阴性对照组，空白对照组中Mfn2的mRNA的相对水平分别是（0.27±0.03），（0.97±0.01），（1.00±0.00）；实验组中Mfn2的mRNA水平低于两对照组，差异有统计学意义（F=2074.682，P＜0.05）。实验组中目的基因Mfn2的沉默效率可高达75%。免疫细胞化学结果经IPP软件分析显示：实验组、阴性对照组和空白对照组Mfn2蛋白的表达水平分别为（335331.67±7216.089）、（637438.67±30060.641）和（673956.67±25132.255）；实验组的Mfn2蛋白水平低于两对照组，差异有统计学意义（F=138.831，P＜0.05）；两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。Westernblot实验结果显示：实验组、阴性对照组和空白对照组中Mfn2的相对表达水平（OD, relative optical density）分别为（0.474019±0.0059504）、（1.144936±0.0256883）和（1.093283±0.0584572）；实验组Mfn2的表达量低于两对照组，差异有统计学意义（F=70.312，P＜0.05）；两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。以上结果提示，siRNA有效沉默了MCF-7细胞内Mfn2基因，导致其mRNA和蛋白水平显著降低。划痕实验结果显示：划痕24h后，实验组、阴性对照组和空白对照组的细胞迁移率分别为（0.1774±0.0065）%、（0.0715±0.0053）%和（0.0649±0.0046）%；实验组的24h细胞迁移率高于两对照组，差异有统计学意义（F=392.782，P＜0.05）；两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。划痕48h后，实验组、阴性对照组和空白对照组的细胞迁移率分别为（0.3200±0.0100）%、（0.1162±0.0054）%和（0.0660±0.0037）%；实验组的48h细胞迁移率高于两对照组，差异有统计学意义（F=1141.329，P＜0.05）；两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。Transwell实验结果显示：实验组、阴性对照组和空白对照组的侵出小室细胞数分别为（900.330±50.501）、（440.000±26.458）和（460.000±20.000）；实验组侵出小室细胞数高于两对照组，差异有统计学意义（F=166.916，P＜0.05），两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。免疫细胞化学结果显示，实验组、阴性对照组和空白对照组中MMP-2蛋白的表达水平分别为（630055.33±26745.600）、（432000.00±8544.044）和（437837.68±5860.727）；实验组的MMP-2蛋白水平高于两对照组，差异有统计学意义（F=1291.687，P＜0.05）；两对照组间无显著性差异（P＞0.05）。Western blot实验结果显示：实验组、阴性对照组和空白对照组中MMP-2的相对值（OD）分别为（1.0067±0.00452）、（0.4507±0.01867）和（0.4334±0.01736）。实验组MMP-2的表达量高于两对照组，差异有统计学意义（F=23.832，P＜0.05）；两对照组间MMP-2表达量无显著差别（P＞0.05）。结论1Mfn2基因表达水平的降低可导致乳腺癌细胞MCF-7的侵袭、迁移能力增强。2Mfn2基因可能通过调控MMP-2的表达影响MCF-7细胞的侵袭迁移能力。