玉米赤霉烯酮对小鼠B淋巴细胞体外活化的影响及机制研究

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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一种由镰刀菌属真菌产生的具有雌激素效应的霉菌毒素,普遍存在于全球各地被污染的谷物及谷物产品中,具有生殖、内分泌、免疫等多种毒性作用,甚至可导致肿瘤的发生,严重影响动物和人类的健康。近年来,玉米赤霉烯酮免疫毒性导致的动物疾病抵抗力下降、传染病易感性升高等现象越来越受到人们的重视,但相关分子机制尚未完全探明。本试验以小鼠脾脏B淋巴细胞为研究对象,通过体外试验研究了 ZEA对体液免疫中起关键作用的B淋巴细胞增殖活化、分泌功能和相关信号通路的影响,旨在揭示ZEA对动物免疫功能影响的机制。1.ZEA对小鼠B淋巴细胞活性及增殖的影响使用免疫磁珠阴性分选法从6-8周龄Balb/c小鼠脾脏中获取原代脾脏B淋巴细胞,以 0(对照组),0.1,1.0,2.5,5.0,10μg/mL 的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分别处理B淋巴细胞24 h,48h,CCK-8法检测LPS激活脾脏B淋巴细胞的效果,筛选合适的活化剂浓度;以0(对照组),5,10,20,40,80μmol/L的ZEA分别处理未添加/添加活化剂LPS(5μg/mL)的B淋巴细胞24h,CCK-8法检测ZEA对脾脏B淋巴细胞活性和增殖的影响。结果显示,24 h时5 μg/mL LPS刺激小鼠脾脏B淋巴细胞活性显著上升(p<0.05)。ZEA染毒未活化的B淋巴细胞浓度达到80 μmol/L时致B淋巴细胞活性显著下降(P<0.05)。添加LPS的ZEA染毒试验中,24 h时20 μmol/L ZEA处理组细胞活性显著低于对照组(p<0.05),40、80μmol/LZEA处理组细胞活性极显著低于对照组(p<0.01);48 h时10μmol/L ZEA处理组细胞活性较对照组显著下降(p<0.05),20、40、80μmol/LZEA处理组细胞活性极显著低于对照组(p<0.01),呈剂量-效应依赖关系。结果说明,LPS能够刺激小鼠脾脏B淋巴细胞活化增殖,ZEA对小鼠B淋巴细胞有毒性作用,ZEA可以抑制小鼠B淋巴细胞增殖活化的能力。2.ZEA对小鼠B淋巴细胞活化分泌功能的影响以分选的小鼠脾脏B淋巴细胞为材料,设立空白对照组(不含LPS)、LPS(5μg/mL)对照组、ZEA(20 μmol/L)+LPS(5 μg/mL)处理组、ZEA(40 μmol/L)+LPS(5 μg/mL)处理组共四组,染毒处理24 h后,利用流式细胞术检测B淋巴细胞表面抗原CD40、CD80、CD86的表达水平,流式液相多重蛋白定量技术检测细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α的分泌水平;利用ELISA试剂盒法检测细胞培养上清液中抗体IgG,IgM的表达水平。结果显示,与空白对照组比较,LPS对照组CD40、CD80表达量均显著升高(p<0.05),CD86表达量极显著升高(p<0.01);与LPS对照组比较,随着ZEA染毒浓度的升高,各染毒组CD40、CD80的分泌量呈现下降趋势,40μmol/L ZEA处理组CD40和CD80的表达量显著降低(p<0.05),CD86的表达量变化不明显(p>0.05)。与空白对照组相比,LPS对照组IL-6、IL-10、TNF-α的分泌量均有极显著上升(p<0.01);与LPS对照组比较,各浓度ZEA处理组IL-6、IL-10、TNF-α的分泌量均极显著下降(p<0.01),且呈剂量-效应依赖关系。与空白对照组相比,LPS对照组抗体IgG分泌量极显著升高(p<0.01);与LPS对照组比较,随着ZEA染毒浓度的升高,染毒组IgG的分泌量呈下降趋势,20 μmol/LZEA处理组IgG分泌量较LPS对照组显著降低(p<0.05),40μmol/L ZEA处理组IgG分泌量较LPS对照组极显著降低(p<0.01)。与空白对照组相比,LPS对照组抗体IgM分泌量显著升高(P<0.05);与LPS对照组比较,ZEA处理组IgM分泌量变化不明显(p>0.05)。结果说明,ZEA可以减少B淋巴细胞表面抗原的表达量,抑制B淋巴细胞有关细胞因子的表达,降低B淋巴细胞分泌相关抗体的能力。3.ZEA对小鼠B淋巴细胞活化相关信号通路的影响以分选的小鼠脾脏B淋巴细胞为材料,设立空白对照组(不含LPS)、LPS(5 μg/mL)对照组、ZEA(20μmol/L)+LPS(5 μg/mL)处理组、ZEA(40 μmol/L)+LPS(5μg/mL)处理组,共同处理24 h后,利用western blot方法检测细胞凋亡信号通路相关蛋白JNK、ERK1/2、P38和NF-κB表达水平的变化情况。结果显示,与空白对照组相比,LPS对照组JNK、ERK1/2、P38和NF-κB蛋白表达量均上升,其中NF-κB蛋白表达量呈显著性升高(p<0.05)。与LPS对照组比较,20 μmol/LZEA处理组J-NK蛋白表达量升高显著(p<0.05),40μmol/LZEA处理组升高极显著(p<0.01);各染毒处理组ERK1/2蛋白表达量均升高(p<0.05);40 μmol/LZEA处理组P38蛋白和NF-κB蛋白表达量均显著性下降(p<0.05)。结果说明,ZEA能够激活JNK、ERK通路蛋白的表达,抑制P38、NF-κB通路蛋白的表达。结论:ZEA可通过抑制多种细胞因子分泌、抗体的分泌和细胞表面抗原的表达,同时干扰维持细胞正常功能的相关通路关键蛋白表达等途径,影响小鼠体液免疫中B淋巴细胞的活化,影响B淋巴细胞正常功能的发挥,致使动物机体发生免疫抑制。
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