组织蛋白酶L是一类半胱氨酸蛋白酶,种类众多且分布广泛,具备多种生物学功能,被较多领域的研究者进行了广泛的研究,在食品及医药研究方面具有极大的潜在价值。Stefin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin超家族的一员,能专一抑制组织蛋白酶L。本实验首先以Stefin为配基自制亲和层析填料CNBr-Stefin-Sepharose 4B并测定其稳定性,随后用于分离纯化草鱼肝胰中的组织蛋白酶L,最后对纯化的组织蛋白酶L进行了分子结构特征鉴定和活性类型鉴定。本实验为以setfin为配基制备亲和层析填料提供了新的思路及实践支持,为以亲和层析法分离纯化鱼类肝胰中组织蛋白酶L提供了实验基础及科学参考依据。本实验所得结果如下:1、重组草鱼Stefin的诱导表达及纯化鉴定首先对转入草鱼Stefin-pET-30a的工程菌E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,通过冻融裂解、细胞破碎、尿素梯度洗涤及Ni+-NTA亲和层析等步骤分离纯化了重组草鱼Stefin,其经Ni+-NTA亲和层析呈现单一峰,SDS-PAGE电泳分析其分子量约为11.4k D。重组草鱼Stefin表现出了对Papain的抑制能力,其抑制活性随Stefin浓度的升高而升高,但对Trypsin和Chymotrypsin不具有抑制能力。对重组草鱼Stefin的稳定性检测表明,Stefin具有较宽的酸碱及热稳定性,其于p H 4-11及4℃-70℃范围内均可保持64%以上的残留抑制活性。2、CNBr-Stefin-Sepharose 4B亲和层析填料的制备和稳定性分析随后采用CNBr活化Sepharose 4B,并以重组草鱼Stefin为配基自制亲和层析填料CNBr-Stefin-Sepharose 4B。紫外光谱检测表明填料被成功活化并成功偶联Stefin。以Stefin偶联量及Papain吸附量为指标,确定CNBr-Sepharose 4B与Stefin的最佳液料比为1:8（w/v）,此时Stefin偶联量为11.22 mg/g,Papain吸附量为5.98 mg/g。对亲和填料CNBr-Stefin-Sepharose 4B进行稳定性检测,结果表明亲和填料在p H 2-10及4℃-40℃范围内表现出较好的稳定性,其最佳使用条件为p H 7,4℃。3、CNBr-Stefin-Sepharose 4B亲和层析纯化草鱼肝胰组织蛋白酶L首先对草鱼肝胰组织蛋白酶L进行粗提取,而后经酸处理及硫酸铵盐析等步骤,最后进行CNBr-Stefin-Sepharose 4B亲和层析纯化。目的蛋白活性部分基本沉淀于80%硫酸铵,此时纯化倍数为1.91,回收率为73.90%。经CNBr-Stefin-Sepharose 4B亲和层析后,纯化了16.45倍,回收率为46.81%。SDS-PAGE及反相酶谱电泳检测表明,目的蛋白酶呈现分子量为33 k D及30 k D的两条条带。TSK gel G2000 SWXL高效液相色谱检测表明,目的蛋白酶主要在保留时间19.262 min（29.4 k D）处呈现主要活性峰。4、草鱼肝胰组织蛋白酶L的结构及活性特性鉴定对纯化后的目的蛋白酶进行分子结构特征鉴定及活性类型鉴定。Con A Sepharose4B外源凝集素亲和层析结果表明,纯化后的目的蛋白酶有两种类型,一种在α-甲基甘露糖苷浓度为0%时被洗脱,证明其不具有糖侧链,另一种在α-甲基甘露糖苷浓度为0.15-0.3 mol/L时被洗脱,证明其具有糖侧链。活性类型鉴定结果表明,相同底物浓度下,纯化后的目的蛋白酶对组织蛋白酶L底物Z-Phe-Arg-MCA的水解活性明显高于对组织蛋白酶B底物Z-Arg-Arg-MCA的水解活性。且该酶能够被巯基激活剂DTT、β-Me和L-Cys激活,其中DTT及β-Me在浓度2 mmol/L时达到最大激活作用,随后激活作用随浓度的增加而降低,而L-Cys的激活作用则在浓度0-20 mmol/L范围内随浓度的增加而上升。E-64对纯化的目的蛋白酶表现出了明显的抑制作用,但PMSF未使该酶失活。综合分子量特征、结构特征和性质判断,目的蛋白酶为草鱼肝胰组织蛋白酶L。