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目的：日本榧树（Torreya nucifer L.）是日本、朝鲜和中国特有的一种红豆杉科植物，其种子有很强的杀虫活性，在我国和朝鲜用于治疗绦虫感染，在日本民间用作流产药。关于日本榧树的化学成分研究主要集中在它的叶子和心材上，其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。本实验以人子宫内膜癌细胞株（HEC-1）、人子宫颈癌细胞株（HeLa）、人卵巢囊腺癌细胞株（HAC-2）、人卵巢透明癌细胞株（HOC-21）和人卵巢透明癌细胞株（SHIN-3）为材料，研究日本榧树果实中纯化得到的3种二萜类化合物（18-羟基弥罗松酚、kayadiol和花柏酚）对这5种妇科肿瘤细胞增殖的抑制作用，并以HEC-1细胞为代表，进一步探讨kayadiol抑制HEC-1细胞增殖的作用机制。方法：1MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法1.1肿瘤细胞株悬液制备用RPMI-1640完全培养基调整实验用肿瘤细胞株浓度为2×105个/mL的细胞悬液备用。1.2体外抑瘤实验取对数生长期的实验用肿瘤细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL（含1×104个细胞），分别加入溶剂对照（终浓度0.1%DMSO）、阳性对照（顺铂）和终浓度为1、10和100μmol/L的5种二萜类化合物各50μL，每组均设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养44h，然后各孔加入5mg/mL的MTT10μL。培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，充分溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值（OD值），并计算肿瘤细胞生存率，细胞生存率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。实验数据用The SPSS system V13.0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的半数抑制浓度（IC50）值。2凋亡细胞原位标记与半定量分析取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于8孔Chamber slide，每孔100μL（含2×104个细胞），分别加入溶剂对照（终浓度0.1%DMSO）和终浓度为10μmol/L的kayadiol100μL，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养12h和24h。采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测。每张切片拍摄5个阳性视野，分别计数每视野正常细胞数和带有荧光的凋亡细胞数，以平均阳性细胞所占的正常细胞的百分比作为细胞凋亡率（apoptotic rate，AR）。3Western blotting检测取对数生长期的HEC-1细胞，按2×106个细胞/培养皿接种。加入终浓度为10μmol/L的顺铂和kayadiol的培养基，培养细胞48h，离心收集细胞，PBS漂洗细胞，加上样缓冲液100μL，剧烈震荡后冰浴下超声波处理1min。100℃加热10min使蛋白质变性，12000r/min离心10min，取上清液测定蛋白浓度。取50μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维膜（NC膜），用5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2h。弃封闭液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15min。膜在抗Bax多克隆抗体（1:500）和抗caspase-3多克隆抗体（1:700）稀释液中室温过夜孵育，1×TBS-T洗膜3次，每次15min，在二抗稀释液（抗鼠1:5000）中孵育40min。再次洗膜后加入ECL试剂，反应1min，用X片曝光1-10min后，显影。4半胱天冬酶抑制剂对kayadiol抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL（含1×104个细胞），分别加入含有半胱天冬酶抑制剂终浓度为1、10和100μmol/L kayadiol和不含半胱天冬酶抑制剂的kayadiol，各50μL，每组均设3复孔，置于培养箱中培养44h，各孔加入5mg/mL的MTT10μL。继续培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，充分溶解结晶，测定OD值，并计算细胞生存率。结果：1MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法结果本实验采用MTT法探讨了3种二萜类化合物（18-羟基弥罗松酚，kayadiol，花柏酚）对5种妇科肿瘤细胞增殖活性的影响。18-羟基弥罗松酚、kayadio和花柏酚对5种妇科肿瘤细胞增值活性有不同的抑制活性。其中kayadio对上述5种细胞的增殖显示强的抑制活性，1、10和100μmol/L kayadio处理的HEC-1细胞，其细胞生存率分别为69.87%、39.31%和2.76%，对HeLa细胞，其生存率分别为89.87%、41.31%和6.76%，对HAC-2细胞，其生存率分别为73.56%、40.15%和17.27%，对HOC-21细胞，其生存率分别为74.44%、50.90%和11.15%，对SHIN-3细胞，其生存率分别为69.24%、43.53%和12.49%，均呈现较好的剂量依赖关系，该化合物10μmol/L组与溶剂对照组相比均具有显著性的差异（P＜0.05），且100μmol/L组具有非常显著性的差异（P＜0.01），IC50分别为3.33μmol/L、8.00μmol/L、5.95μmol/L、7.20μmol/L和5.12μmol/L。阳性对照顺铂的IC50分别为15.91μmol/L、34.36μmol/L、38.34μmol/L、44.53μmol/L和5.32μmol/L（Fig.2and Table1）。2kayadiol对HEC-1细胞凋亡原位标记与半定量分析使用10μmol/L的kayadiol处理HEC-1细胞后，观察HEC-1细胞凋亡情况，结果显示，溶剂对照组、12h组和24h组HEC-1细胞凋亡率分别为（2.40±1.20）%、（40.16±6.84）%和（86.88±6.00）%，kayadio可明显诱导HEC-1细胞的凋亡，并呈现较好的时间依赖关系（Fig.3,Aand B）。3kayadio对HEC-1细胞内Bax和caspase-3蛋白的上调作用为了进一步探讨kayadio对HEC-1细胞内Bax和caspase-3蛋白的影响，使用10μmol/L的kayadio处理HEC-1细胞48h后，通过Western blotting方法检测细胞内Bax和caspase-3蛋白的变化。结果显示，kayadio作用HEC-1细胞48h后，细胞内的Bax和caspase-3蛋白表达显著上调（Fig.4,A, B and C）。4半胱天冬酶抑制剂对kayadio抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用使用1、10和100μmol/L的kayadio处理HEC-1细胞，其细胞生存率分别为69.87%、39.31%和2.76%，使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与kayadio共同孵育HEC-1细胞后，其细胞生存率分别为80.78%、36.27%和8.98%，在浓度为1和100μmol/L的细胞细胞生存率上升显著（Fig.5）。结论：日本榧树果实中化合物能显著抑制人妇科肿瘤细胞的增殖活性；kayadio抑制HEC-1增殖活性的作用机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。诱导细胞凋亡是一个由多信号诱导、多基因调控和多因子参与的过程，本实验验证的仅仅是诱导凋亡的通路之一，kayadio是否还通过其他通路来达到诱导凋亡的结果，还未可知。因此kayadio诱导妇科肿瘤细胞凋亡的机制还不是非常清楚，需要进一步研究。