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龙眼（Dimocarpus longan Lour）是我国热带和亚热带名贵特色果树,其果实当中含有丰富的类黄酮和类胡萝卜素等多种次生代谢产物,具有极高的食用和药用价值。根据植物细胞全能性的原理,愈伤组织同样可以用于次生代谢产物的生产,而龙眼胚性培养物具有生长速度快,增殖系数大,再生能力强等诸多优点。生物钟参与调控植物体中几乎所有的生长发育和新陈代谢,其中光信号也可影响植物的代谢情况。本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究了生物钟光周期和MeJA对龙眼愈伤组织和胚性悬浮细胞对类黄酮和类胡萝卜素积累及其合成相关基因表达的影响;研究了不同光周期处理下对各细胞保护酶活性的影响;同时研究了生物钟核心振荡器重要组成基因PRRs家族基因在生物钟光周期、MeJA和体胚发生时期的表达情况;研究了PRRs家族基因的生物信息学情况。以期为研究生物钟调控在龙眼胚性愈伤组织生产类黄酮和类胡萝卜素等次生代谢产物中的影响的研究奠定基础。本试验主要结果如下:1生物钟光周期对龙眼胚性愈伤组织类黄酮和类胡萝卜素积累的影响以龙眼松散型胚性愈伤组织（‘红核子’品种LC2细胞系）为试验材料,研究全光照24 h/0 h L/D、长光照18 h/6 h L/D、半光照12h/12h L/D、短光照6 h/18h L/D、全黑暗0 h/24 h L/D五种光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。试验结果表明:短光照6 h/18 h L/D处理下的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量和产量均为最高,分别是4.733 mg/g（DW干重）和0.2993 mg/瓶（DW干重）;在24 h光照处理下类黄酮的含量和产量均最低,仅为2.800 mg/g（DW干重）和0.1766 mg/瓶（DW干重）;不同光周期处理对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量和产量影响的高低顺序一致,排列顺序如下:6h>12h>18h>0h>24h。全光照24 h/0 h L/D处理下龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量和产量最高,分别为51.25μg/g（DW干重）和3.2697μg/瓶（DW干重）;半光照12 h/12 h L/D处理下的类胡萝卜素含量和产量均最低,仅为41.25μg/g（DW干重）和2.7772μg/瓶（DW干重）;不同光周期处理下对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量和产量的高低顺序为:24h>0h>6h>18h>12h。2生物钟光周期对龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶活性的影响以龙眼松散型胚性愈伤组织（‘红核子’品种LC2细胞系）为试验材料,研究不同光周期处理20d时龙眼胚性愈伤组织中SOD、POD、PRO、H2O2、PAL细胞保护酶的变化情况。试验结果表明:不同光周期处理下龙眼胚性愈伤组织中SOD酶活性情况如下:12h>18h>24h>0h>6h;POD酶活性情况如下:0h>12h>18h>6h>24h;PRO含量情况如下:24h>0h>18h>6h>12h;H2O2含量情况如下:12h>18h>0h>24h>6h;PAL酶活性情况如下:6h>18h>0h>24h>12h。3 PRRs家族基因的生物信息学分析及其在龙眼体胚发生时期的表达分析以龙眼基因组数据库（NCBI登录号:BioProject PRJNA305337）为材料,利用生物信息学分析方法,对龙眼PRRs基因家族进行鉴定与功能分析,获得5个家族成员,分别为PRR1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9。进化树分析表明龙眼中PRRs基因家族可分成三个亚组,PRR1单独一组,PRR3和PRR7聚为一组,PRR5和PRR9聚为一组。保守结构域分析发现龙眼PRRs家族基因在N端均具有REC保守结构域,C端均具有CCT模块,且每个成员均具有三个相同的蛋白motif。蛋白性质分析结果表明:此家族基因均为不稳定的亲水性蛋白、酸性蛋白,而且PRRs家族成员均具有多个膜内向膜外和膜外向膜内的跨膜结构。基因结构分析表明:PRRs家族成员均具有内含子。亚细胞定位分析表明:PRR1定位于细胞核和线粒体,其他四个基因均定位于线粒体。启动子顺式作用元件分析结果表明:PRRs启动子区域不仅包含大量的TATA-box和CAAT-box核心元件,还包含大量的光响应元件,部分基因具有调节激素水平的元件以及低温、干旱、厌氧诱导和昼夜调控等元件。对在不同体胚情况下的龙眼PRRs基因家族成员进行实时荧光定量PCR表达可得:PRRs家族成员的表达模式有两种,其一PRR1、3、7、9是倒“V”字型表达模式,其二PRR5为直线型下降表达模式。其中,PRR1/3/7均是在IcpEC阶段表达量最高,龙眼体胚发生过程是一个大量基因差异表达、物质能量改变和形态进程的复杂过程,PRRs家族基因的转录水平变化也很复杂,具有一定的时间阶段效应。PRR1、3、7、9在这体胚发生的四个阶段当中,前期表达量迅速上升,然后便迅速下降,PRR5在这四个阶段当中一直呈下降的状态。在这个过程当中,植物体外部并没有明显变化,但是内部基因的表达变化剧烈。在不同体胚发生时期的处理下,PRRs家族各成员有两种表达模式,一种是“一”字式的,基本没有变化,第二种是“M”字式的,先上升后下降再上升再下降形式。这说明龙眼PRRs家族基因在不同的体胚发生时期的表达量各不相同。4 MeJA对龙眼胚性悬浮细胞增殖的影响和类黄酮与类胡萝卜素积累的影响试验结果表明:MeJA抑制龙眼悬浮细胞的增殖;当MeJA浓度为200μmol/L时,其类黄酮含量最高为3.11 mg/g（DW干重）;当MeJA浓度为0μmol/L时产量最高为0.82 mg/瓶（DW干重）;当MeJA浓度为400μmol/L时,其类胡萝卜素含量最高,为44.12μg/g（DW干重）,极显著高于对照组含量;在MeJA浓度为300μmol/L时产量最高为7.11μg/瓶（DW干重）。5光周期和MeJA处理下龙眼生物钟PRRs家族基因的表达分析试验结果表明:PRRs家族5个成员在不同光周期处理中的表达模式并不相同,可以分为三种不同的表达模式,分别为:PRR1为倒“V”字表达模式;PRR3为“V”字表达模式,它是生物钟的特异性组成部分;PRR5、7、9均为“M”字表达模式,是生物钟早晨循环的组成部分。PRR5和9作为两个亲缘性较高的成员,它俩的表达模式一致。PRR3和7作为两个亲缘性较高的成员,它俩的表达模式并不相同,其中PRR7和PRR5、9的表达模式一致,而PRR3则是自己单独的一种表达模式。除表达模式以外,PRRs家族基因的相对表达量也有一定规律,其中PRR1、5、9的相对表达量均为6h时最高。PRRs家族的5个成员在不同浓度MeJA的处理下的表达模式各不相同,但是均在MeJA浓度为400μmol/L时其基因的表达量最高。6光周期和MeJA处理下龙眼中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因的表达分析试验结果表明:光周期处理下类黄酮合成基因CHI和CHS为“M”字表达模式;DFR和F3H为倒“V”字表达模式;类胡萝卜素合成所用的四个基因表达模式各不相同。不同浓度MeJA处理下类黄酮合成基因CHI、CHS和DFR均为“W”字表达模式,F3H为先上升后下降在上升的表达模式。类胡萝卜素合成所用GGPS、PSY、PDS和ZDS四个基因均为“W”字表达模式,且表达量相似。