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目的:宫颈癌现阶段的治疗方法主要包括手术、放化疗,手术往往会使女性失去生育能力。放化疗也给患者带来巨大的生理、心理痛苦。现在随着对宫颈癌、癌前病变的认识加深,发现自身免疫在疾病的发生、发展或疾病的逆转、转归乃至自愈过程中发挥着重要作用。乳酸杆菌是存在于人和动物口腔、消化道、阴道的正常菌群。在临床上,乳酸杆菌主要用于增强患者的免疫力。现今关于阴道菌群与HPV感染、宫颈癌前病变、宫颈癌的发生之间的研究越来越多。有研究显示乳酸杆菌可以抑制宫颈癌增殖。本研究亦发现乳酸杆菌能很好的抑制宫颈癌细胞的增殖与转移。癌细胞的无限增殖是肿瘤发生发展的基础,Cyclin作为控制细胞增殖、凋亡的原癌基因受到了广泛关注,乳酸杆菌可以抑制宫颈癌细胞的生长,但是乳酸菌抑制宫颈癌细胞生长、增殖的机制尚不明确。本研究旨在探求乳酸杆菌抑制宫颈癌细胞增殖的可能机制,为以后乳酸杆菌预防与治疗宫颈癌提供理论依据,并力图探索宫颈癌治疗的可能靶点。方法:基于前期实验,发现乳酸杆菌与Hela细胞MOI为1000:1的状态下,作用效果最佳,本次实验乳酸杆菌与Hela细胞MOI均为1000:1。1乳酸杆菌对宫颈癌Hela细胞增殖作用1.1增殖实验乳酸杆菌作用Hela细胞0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h,MTS细胞增殖试剂盒检测乳酸杆菌对Hela细胞增殖的影响。1.2乳酸杆菌抑制Hela细胞增殖的可能机制研究乳酸杆菌直接作用于Hela细胞,以3×105/孔铺于6孔板中,置37℃、5%CO2培养箱过夜。乳酸杆菌以MOI 1000:1作用于细胞。对照组加入2ml无双抗DMEM高糖培养基,培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后,收集细胞备用。1.2.1实时定量PCR检测乳酸杆菌作用后Dvl-1、Dvl-2、Dvl-3、GSK3β、CSL、NLK、Cyclin D1 m RNA水平变化。1.2.2 Western blot检测乳酸杆菌作用后不同时间点β-catenin、GSK3β、CSL、NLK、Cyclin D1的蛋白水平变化。2行Si RNA干扰Hela细胞NLK的基因表达后,乳酸杆菌对Hela细胞增殖作用的影响。2.1实时定量PCR检测Si RNA干扰效果2.2增殖实验设置空白对照组、阴性干扰组、干扰组,Si RNA作用24h后,加入乳酸杆菌作用0h、12h、24h、36h、48h、60h,MTS细胞增殖试剂盒检测乳酸杆菌对干扰NLK基因表达后的Hela细胞增殖的影响。2.3实时定量PCR检测Si RNA干扰Hela细胞后,乳酸杆菌作用48h NLK、Cyclin D1核酸水平变化,Western blot检测NLK、Cyclin D1蛋白水平变化。3统计方法用SPSS(21.0版)统计软件行数据分析,对于符合正态分布的数据以平均值±标准差描述,两样本间行t检验或t’检验,多样本分析运用方差分析;非正态数据用秩和检验,对于率、比的比较行卡方检验。结果:1乳酸杆菌作用Hela细胞后,显微镜下显示随着作用时间延长,Hela细胞生长速度减慢,细胞碎片随时间增加明显增多,MTS结果显示乳酸杆菌作用36小时后,细胞增殖明显减弱,乳酸杆菌作用组与空白组相比,差异具有统计学意义(F=20.793,P=0.000145)。2乳酸杆菌作用Hela细胞后,Wnt通路中的接头蛋白Dvl的三个亚基(Dvl-1、Dvl-2、Dvl-3)m RNA水平表达趋势一致,表现为菌作用后其表达量迅速增加,24小时后,表达逐渐减少,提示乳酸杆菌作用后,可能激活了Wnt通路。GSK3βm RNA水平整体呈上升趋势,与空白对照组相比,具有显著差异(F=25.549,P=0.000);然而GSK3β蛋白表达量明显降低(F=34.151,P=0.000),呈时间依赖性;原因可能是活化的Dvl蛋白能抑制GSK-3β的活性。与其结合的靶蛋白β-catenin在乳酸杆菌作用细胞后,与空白对照组相比,表达量显著升高,但不同作用时间组之间无显著差异。然而其下游的Cyclin D1无论是m RNA水平还是蛋白水平呈现稳定的下降趋势,与空白对照组相比,差异具有显著性。提示乳酸杆菌并非通过激活经典Wnt通路发挥抑制Hela细胞增殖作用。3乳酸杆菌作用Hela细胞后,Notch通路中的关键接头分子CSL无论从m RNA水平还是蛋白水平的表达量与空白对照组相比均显著增加;而受其抑制的下游的Cyclin D1无论是m RNA水平还是蛋白水平呈现稳定的下降趋势,与空白对照组相比,差异具有显著性。提示Notch通路中的接头分子CSL可能在乳酸杆菌抑制Hela细胞增殖作用中发挥作用。4 BMP通路中的关键分子NLK则在乳酸杆菌作用细胞后,其m RNA水平表达不稳定,但NLK的蛋白表达随作用时间显著增多(F=20.703,P=0.000),而受其抑制的下游的Cyclin D1无论是m RNA水平还是蛋白水平呈现稳定的下降趋势,与空白对照组相比,差异具有显著性。5 Si NLK干扰Hela细胞中NLK表达后,NLK抑制率达80%。6 Si NLK干扰NLK表达后,Si NLK干扰组Hela细胞生长状态优于空白对照组、阴性干扰组,MTS结果显示Si NLK干扰组细胞增殖优于空白对照、阴性干扰组。乳酸杆菌加入后,干扰组细胞生长状态仍优于空白对照组、阴性干扰组。MTS结果显示Si NLK干扰组的细胞增殖明显优于空白对照组、阴性干扰组,差异具有统计学意义。7 Hela细胞中NLK表达被干扰后,乳酸杆菌再作用细胞48h,Cyclin D1无论m RNA水平或蛋白水平的表达量都较干扰前或阴性干扰组明显升高。空白对照组与阴性干扰组间无统计学差异(P=0.091)。提示BMP通路中的NLK在乳酸杆菌抑制Hela细胞增殖发挥重要作用。结论:1乳酸杆菌可以抑制Hela细胞增殖、生长。2乳酸杆菌作用Hela细胞后Cyclin D1表达显著降低。3乳酸杆菌并非通过Wnt经典途径抑制Hela细胞增殖。4乳酸杆菌可能通过上调Notch通路中的CSL,抑制Hela细胞增殖。5乳酸杆菌同时上调BMP通路中的NLK,抑制Cyclin D1表达进而抑制Hela细胞增殖。