酶标二抗是一种伴随着免疫检测诞生的试剂,既拥有作为抗体的高度特异性和敏感性,又拥有可以高效催化酶底物的能力。对比直接进行免疫检测的酶标一抗具有提高效率、降低成本、减少假阳性和信号级联放大的作用。羊抗鸡酶标二抗与同类产品相比具有诸多优势,以鸡作为抗原的免疫宿主拥有更广的抗原测定的范围,将羊抗体作为二抗则拥有很大的市场前景。羊抗鸡酶标二抗的制备有四个关键技术,即鸡卵黄抗体的提纯、羊免疫反应、羊血清(血浆)抗体的提纯以及酶联反应。本研究在综合前人研究工作的基础上,拟建立酶标二抗的制备方法。论文实验结果如下:(1)以多个方法制备鸡卵黄抗体IgY并对各方法进行比较。水稀释-乙醇分级沉淀,氯仿-乙醇分级沉淀,氯仿-DEAE柱层析以及氯仿-硫酸铵二次沉淀法得到的蛋白质纯度分别:54%,55%,80%和91%。水稀释-乙醇分级沉淀法IgY得率为11.99mg每个鸡蛋,氯仿-乙醇分级沉淀法蛋白得率为16.50mg每个鸡蛋,四种方法中IgY得率最高的是氯仿-硫酸铵二次沉淀法,每个鸡蛋中可以提取17.26mg IgY。氯仿-DEAE柱层析法和氯仿-硫酸铵二次沉淀法都可以得到高纯度IgY,但综合效率和成本等因素后,选择以氯仿-硫酸铵二次沉淀法作为一抗的提纯方法。(2)羊免疫反应时只有首免和二免用加佐剂的IgY做抗原,一免、二免和三免抗原的量为200mg,四免时所用的抗原量为300mg,五免通过颈部静脉注射经加热凝聚后的IgY 300mg。两只实验羊均无严重的过敏反应。免疫反应完成后从颈静脉取血。(3)使用辛酸-硫酸铵法提纯羊血浆中的IgG,得到的抗体纯度为80%,得率为0.9mg每毫升血浆。(4)使用高碘酸钠氧化法使羊IgG与HRP的共价交联反应。为检测酶标羊二抗对鸡卵黄一抗的结合能力以及交联反应的效果,将一抗IgY经SDS-PAGE电泳后转至NC膜上,然后与酶标羊二抗温育结合,化学发光反应后曝光。结果显示,IgY样品中没有阳性曝光带出现。尚不确定是IgG与HRP未能发生有效交联,抑或是鸡卵黄一抗抗原未能引发羊的免疫反应,产生足够量的二抗IgG。