目的：本实验作为本研究所研究课题的一部分，主要研究了临床上常见也是很重要的菌株肺炎克雷伯菌的耐药质粒。细菌耐药性的改变，大多与细菌所携带的基因有关，而这些基因往往位于耐药菌所携带的质粒上，可通过质粒或质粒所携带的可移动元件在细菌群体中播散。因此我们有必要通过对质粒DNA序列的测定，分析质粒所携带的功能基因，从基因组水平研究肺炎克雷伯菌质粒DNA的结构，质粒与宿主菌的耐药性和致病性等的关系，为进一步分析肺炎克雷伯菌质粒DNA结构的演变规律和分子进化，以及肺炎克雷伯菌的耐药性和致病性机理的研究打下基础。 方法：本课题从温州医学院附属第一医院临床分离的一株多重耐药肺炎克雷伯菌作为本实验菌株来源。首先，确定临床来源的多重耐药的肺炎克雷伯菌，采用碱裂解法提取质粒DNA，构建小片段pUC18文库和大片段的fosmid文库，并测序。再采用Phred/Phrap/Consed软件包进行序列拼接，获得质粒全序列。然后进行质粒DNA的ORF查找(Glimmer3软件)和功能注释，BLAST比较蛋白数据库(Pfam，InterPro，NCBI库)和COGs，确定蛋白家族，多序列比对使用ClustalW。进一步对这些基因进行功能分析，并在基因组水平上研究肺炎克雷伯菌质粒耐药性的传播、演变规律及分子进化机制。 结果：通过上述实验，得到如下结果： 1.成功构建了一个包含所有质粒DNA的插入片段大小为2-3Kb的pUC18文库，和35-40Kb的。fosmid文库。 2.测序拼接后得到3个环状双链DNA质粒：pKF3-70(69477bp)、pKF3-90(91327bp)和pKF3-147(147415bp)。 3.其中对质粒pKF3-147DNA分析表明，质粒pKF3-147DNA全基因组序列大小为147，415bp，为一个环状质粒，共编码177个ORF，G+C平均百分含量为52.5％，ORF的平均长度为688bp，编码基因序列占整个基因组的82.6％。在预测的ORF中，有105个ORF(59.3％)编码的基因在已知数据库能找到已知功能的同源基因，能够赋予功能，18个ORF(10.2％)编码保守的假定蛋白，剩余54个(30.5％)在已知数据库里没有同源蛋白基因序列。 4.质粒pKF3-147DNA存在编码毒力相关基因、接合转移功能基因、抗药基因和其它功能基因，包括aac(抗氨基糖苷类药物，ORF0106)，dhfr(甲氧苄啶磺胺类，ORF135)，aph(氨基糖苷类药物，ORF125)，sulⅠ、sulⅡ(磺胺类药物，ORF132，ORF1222)，str(链霉素，ORF120，ORF121)和aadA4(链霉素，ORF134)，tetRA(四环素，ORF118，ORF119)和qac(季铵化合物，ORF133)。其中ORF132-ORF135是一个Ⅰ类整合子基因盒。 结论：以上研究表明： 1.本实验成功地分离并测序分析了临床重要病原菌肺炎克雷伯菌的耐药质粒DNA全序列。 2.质粒pKF3-147DNA存在编码接合转移功能基因、抗药基因和其它功能基因等。质粒DNA存在大量抗药基因，解释了本菌株的多重耐药现象。质粒上存在编码-整套F质粒相关的接合转移系统基因和整合子基因盒，表明这个细菌的耐药性可能通过质粒在不同菌种或菌株间进行水平基因转移，引起耐药性、致病性和其他功能基因的播散。 3.质粒pKF3-147与Escherichiacoli的IncF质粒(不相容性质粒)pIP1206，pUT189，F质粒编码基因存在高度的相似性。可能是经过水平基因转移重组形成的。