植物雌激素是一类来源于植物的杂环多酚类化合物,主要包括异黄酮、香豆素和木脂素三大类,其结构与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)相似,所以可与内源性雌激素竞争体内雌激素受体(Estrogen receptor,ER)。大多数植物雌激素对雌激素敏感性细胞具有双相调节作用,发挥类雌激素或者抗雌激素的生物学效应。目前,关于植物雌激素是抗肿瘤还是促进肿瘤生长的作用,以及其作用机制尚未十分清楚。为了探讨膳食中植物雌激素对乳腺肿瘤生长的作用,本研究以体外细胞实验为主,选取三种具有代表性的植物雌激素:染料木素(Genistein,Gen)、槲皮素(Quercetin,Que)和香豆雌酚(Coumestrol,Cou),以雌激素依赖型的MCF-7乳腺癌细胞为对象,并以人体正常摄入的植物雌激素剂量为基准剂量,同时考虑内源性雌激素的影响因素,研究这三种植物雌激素对MCF-7细胞增殖、凋亡的影响。此外,本研究进一步从分子水平上探讨植物雌激素的雌激素样作用以及相关信号通路之间的关系,深入地阐释植物雌激素对乳腺肿瘤影响的作用机制。最后,辅以荷瘤裸鼠模型,对体内环境下植物雌激素对乳腺肿瘤生长的影响做初步的探讨,进而较为全面系统的研究植物雌激素对乳腺癌细胞MCF-7生长的雌激素样作用。主要研究内容如下:1、体外研究Gen、Que、Cou的雌激素样作用。从人类摄入植物雌激素的基准剂量出发,用0.001-1 μmol/L的Gen、Que、Cou作用于ER表达阳性的MCF-7乳腺癌细胞,MTT法发现细胞活力增加,同时,流式细胞术分析细胞周期分布和细胞凋亡率,结果显示细胞凋亡率减少,G0G1细胞减少,G2/M和S期细胞增加,表明这三种植物雌激素对MCF-7细胞具有促进DNA合成并诱导细胞增殖的作用。为模拟人体内源性雌激素环境,将Gen、Que、Cou与10-10mol/L浓度的E2共同作用,结果显示,Gen+E2、Que+E2、Cou+E2也以同样的方式促进细胞增殖。此外,通过Western Blot检测ERα蛋白,发现蛋白表达随时间变化,6h为最大表达量,其拮抗剂Fulvestrant(Ful)能抑制细胞活力。结论:内源性雌激素环境下,Gen、Que、Cou通过ER通路诱导细胞增殖,发挥雌激素样作用。2、筛选参与Gen、Que、Cou雌激素样作用的信号通路。通过Western Blot检测p-Akt、p-ERK1/2、核内NF-κB p65蛋白表达,它们的时间-效应关系显示,p-Akt、p-ERK1/2、核内NF-κBp65蛋白表达随时间变化,分别在6h、6h、12h时达到最大表达量,说明Gen+E2、Que+E2、Cou+E2激活了 PI3K/Akt、ERK、NF-κB 信号转导通路。此外,PI3K/Akt、ERK 和 NF-κB通路的抑制剂:LY294002、PD98059和PDTC均能抑制由Gen+E2、Que+E2、Cou+E2诱导的细胞增殖。结论:内源性雌激素环境下,PI3K/Akt、ERK、NF-κB三条通路参与调控Gen、Que、Cou诱发的乳腺癌细胞增殖,它们可能与Gen、Que、Cou发挥类雌激素效应的分子机制有关。3、研究Gen诱导的ER、PI3K/Akt、ERK、NF-κB信号通路之间的关系。以植物雌激素中具有典型代表性的一种Gen为例,研究各通路之间的关系。通过Western Blot,发现ER通路拮抗剂Ful抑制Akt的磷酸化,表示PI3K/Akt可能是ER的下游通路;PI3K抑制剂LY294002抑制ERK1/2的磷酸化,表示ERK通路的激活可能在PI3K/Akt的激活之后;ERK1/2抑制剂PD98059抑制细胞核内NF-κB p65的表达,表示NF-κB进入细胞核内发挥作用是在ERK的激活之后。结论:内源性雌激素环境下,Gen依次激活了 ER、PI3K/Akt、ERK、NF-κB通路,发生了 ER介导的非基因组作用,同时证实了这四条信号通路参与植物雌激素诱导的类雌激素效应。4、初步探讨Gen对裸鼠MCF-7乳腺癌细胞移植瘤生长的影响。以植物雌激素中具有典型代表性的一种Gen为例,研究体内环境下植物雌激素与乳腺肿瘤生长之间的关系。通过将MCF-7乳腺癌细胞移植到裸鼠体内,建立了荷瘤裸鼠模型。给此模型灌胃Gen 10天后,对裸鼠体内瘤体大小进行观察和测量,发现体内环境下Gen能促进肿瘤生长,该结果是对体外细胞实验的补充。结论:体内环境下,Gen具有促进MCF-7乳腺癌细胞增殖的作用,与细胞实验的结果是相符合的。综上所述,本论文选用雌激素敏感性的MCF-7乳腺癌细胞以及6周龄裸鼠为对象,研究Gen、Que、Cou在体内外环境下,对乳腺癌细胞以及肿瘤生长的影响,并对它们的雌激素样作用做信号通路探索,实验结果可为创建食源性植物雌激素致癌风险评估平台和指导人们的日常饮食提供一些参考依据。