【摘 要】
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目的:氟（Fluorine,F）是一种非金属元素,以氟化物的形式广泛分布于自然界。适量的氟对人体有益,具有预防龋齿、促进机体发育的作用。但长期摄入过量的氟可导致地方性氟中毒。氟中毒病人出现不同程度的骨骼肌损伤,如骨骼肌萎缩、肌张力升高等症状,但其具体机制尚未完全阐明。成纤维细胞生长因子21（Fibroblast Growth Factor 21,FGF21）是生物细胞中一种调控胚胎发育、组织再生以
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（82073497）；
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目的:氟（Fluorine,F）是一种非金属元素,以氟化物的形式广泛分布于自然界。适量的氟对人体有益,具有预防龋齿、促进机体发育的作用。但长期摄入过量的氟可导致地方性氟中毒。氟中毒病人出现不同程度的骨骼肌损伤,如骨骼肌萎缩、肌张力升高等症状,但其具体机制尚未完全阐明。成纤维细胞生长因子21（Fibroblast Growth Factor 21,FGF21）是生物细胞中一种调控胚胎发育、组织再生以及代谢稳态的蛋白。FGF21激活多种下游信号通路调控细胞功能,但氟是否通过FGF21及下游MAPK/ERK信号通路调控肌细胞分化尚未见报道。因此,我们选取小鼠C2C12成肌细胞进行体外培养,观察氟是否抑制成肌细胞的分化,并探讨FGF21/ERK信号通路在此过程中发挥的作用。本研究为阐明氟导致的骨骼肌损伤机制研究提供新的线索,为氟骨症的防治提供依据。实验方法:选取小鼠C2C12成肌细胞,培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的生长培养液中。待细胞融合至80%时,将培养液更换为含2%马血清的分化培养液诱导C2C12细胞的分化。采用CCK8检测氟对C2C12细胞存活率的影响,确定染氟浓度及染氟时间;倒置显微镜下观察细胞形态的变化及肌管形成情况;免疫荧光检测氟对肌球蛋白重链My HC蛋白表达的影响并计算肌管融合指数;Western Blot和q RT-PCR分别检测氟对C2C12细胞分化相关基因（Myo D、Myo G、My HC）、萎缩相关基因（Mu RF1和MAFbx）和FGF21及受体FGFR1、KLB的m RNA和蛋白表达的影响;Western Blot检测氟对MAPK/ERK信号通路相关基因（Raf、MEK、ERK）的表达的影响。应用FGF21重组蛋白,进一步验证氟是否通过FGF21抑制MAPK/ERK信号通路进而影响肌细胞分化。结果:1.氟对C2C12细胞存活率及分化的影响:与对照组相比,染氟浓度为10-3M时,C2C12细胞细胞存活率显著降低（P＜0.001）;在低血清条件下分化5天时,对照组细胞相互融合,生成多核的肌管。与对照组相比,染氟组细胞肌管数量减少,细胞融合指数下降;与对照组比较,染氟组细胞Myo D、Myo G和My HC的m RNA和蛋白表达均显著下降（P＜0.05）。2.氟对C2C12细胞肌管萎缩的影响:与对照组比较,染氟组细胞Mu RF1和MAFbx的m RNA和蛋白表达均显著升高（P＜0.05）。3.转录组测序结果:基于FDR＜0.05和|Log2 Fold Change|＞1的基准,与对照细胞相比,在染氟组细胞中共筛选出129个差异基因。KEGG结果显示差异基因富集于153条通路。4.氟对C2C12细胞FGF21及MAPK/ERK信号通路的影响:与对照组比较,染氟组细胞FGF21、FGFR1和KLB的m RNA和蛋白表达显著下降（P＜0.05）;与对照组比较,染氟组细胞磷酸化Raf、MEK和ERK的蛋白表达均显著下降（P＜0.05）。5.FGF21处理上调氟抑制的FGF21/ERK信号通路相关因子的表达:外源性加入FGF21后,与染氟组比较,Na F+FGF21组细胞FGFR1、KLB蛋白表达显著高（P＜0.05）,Na F+FGF21组细胞磷酸化Raf、MEK和ERK表达显著高于染氟组（P＜0.05）。6.FGF21处理恢复氟抑制C2C12细胞的分化:FGF21处理逆转氟对C2C12肌管形成的抑制作用;Na F+FGF21组细胞Myo D、Myo G的蛋白表达显著高于染氟组（P＜0.05）。7.FGF21处理恢复氟导致的C2C12细胞肌管萎缩:染氟组细胞中Mu RF1、MAFbx的蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）。Na F+FGF21组细胞Mu RF1、MAFbx的蛋白表达显著低于染氟组（P＜0.05）。结论:氟下调C2C12细胞中FGF21及其受体的表达,抑制其下游MAPK/ERK的磷酸化,进而抑制C2C12细胞成肌分化。
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