脯氨酰内肽酶（Prolyl endopeptidase,PEP,EC3.4.21.26）是属于丝氨酸蛋白酶家族中一类特殊的蛋白酶,通过特异性分解长度小于33个氨基酸并含有脯氨酸残基的寡肽参与学习和记忆,细胞增殖和分化,葡萄糖代谢等许多生物过程。然而,相较于哺乳动物PEP,对水产动物PEP的研究相对较少,PEP在水产动物中的功能尚不明确,不同水产动物PEP之间是否存在差异性也有待研究。本研究以海水鱼日本真鲈（Lateolabrax japonicus）、淡水鱼鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）和贝类皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）为主要研究对象,分析鱼类和贝类中PEP的性质和结构差异。前期研究中,发现鲈鱼和鲢鱼肌肉中存在PEP,但贝类PEP的研究尚未报道。试验发现,皱纹盘鲍PEP在性腺中的酶活力最高。因此,利用硫酸铵分级沉淀以及连续柱层析方法,从鲈鱼肌肉、鲢鱼肌肉和皱纹盘鲍性腺分离纯化PEP,分子量分别为84 k Da、80 k Da和82 k Da,表明PEP的分子量在不同物种间存在差异。酶学性质研究发现,鲈鱼和鲢鱼PEP的最适温度为35°C,而皱纹盘鲍PEP为25°C,三种PEP的最适p H均为6.0,表明PEP是一种低温偏酸性的酶。底物特异性和蛋白酶抑制剂对PEP活性的影响实验结果表明,PEP属于丝氨酸蛋白酶家族中一类特殊的蛋白酶。荧光定量PCR结果表明,PEP在鱼类脑组织中和皱纹盘鲍性腺组织中表达水平最高。进一步分析PEP在皱纹盘鲍雌雄性腺发育过程中的表达水平,PEP在雌性性腺成熟后期的表达量最高,在雄性性腺发育的生长中期表达量达到最大值。PEP在皱纹盘鲍性腺发育不同时期表达量的差异,表明PEP可能参与到皱纹盘鲍性腺发育过程。为了进一步比较三种PEP氨基酸序列的差异性,本研究克隆得到鲢鱼PEP的开放阅读框,全长2223 bp,共编码741个氨基酸残基。与前期已报道的鲈鱼、皱纹盘鲍PEP序列综合比较分析发现,鲈鱼和鲢鱼PEP在N端比皱纹盘鲍多编码了35个氨基酸残基。鲈鱼与皱纹盘鲍PEP的同源性为58.7%,鲢鱼与皱纹盘鲍PEP的同源性为58.97%,鲈鱼与鲢鱼PEP的同源性则高达98.65%。经预测,鲈鱼PEP的理论分子量84.1 k Da,等电点5.91,包含91个带负电氨基酸和76个带正电氨基酸。鲢鱼PEP的理论分子量84.2 k Da,等电点5.93,开放阅读框全长中包含99个带负电氨基酸,77个带正电氨基酸。皱纹盘鲍PEP的理论分子量80.3 k Da,等电点5.55,包含95个带负电氨基酸和75个带正电氨基酸。同源建模结果表明,鲈鱼和鲢鱼PEP在结构上与皱纹盘鲍PEP晶体结构（PDB:6JYM）相似,包括一个典型的催化三联体结构,具有丝氨酸蛋白酶家族的典型特征。PEP蛋白结构呈现典型的α/β蛋白酶特征,由催化结构域和β-螺旋桨两个结构组成。为研究PEP内源性抑制剂对PEP性质和结构的影响,采用热处理、硫酸铵盐析和连续柱层析方法,从皱纹盘鲍性腺中得到PEP的内源性抑制剂（Prolyl endopeptidase Inhibitor,PEPI）。SDS-PAGE和PAS染色结果表明,PEPI是分子量为12 k Da的糖蛋白。PEPI属于可逆的竞争性抑制剂,在40-90°C和p H 5-12的范围内能够保持80%的抑制活性,对热和p H稳定性强。在PEPI存在下,混合后蛋白的（α+β）结构总含量较PEP下降了2.7%,PEP的热变性温度由52°C提高至65°C,表明PEP与抑制剂混合之后,PEP-PEPI复合物在热变性过程中构象的稳定性得到了提高。本研究较为详细地比较了鲈鱼、鲢鱼和皱纹盘鲍PEP的酶学性质,克隆得到鲢鱼PEP的ORF序列,比较了三种PEP氨基酸序列、二级和三级结构的差异,进一步分析了PEP在鲈鱼和皱纹盘鲍不同组织中表达水平的差异,为深入探究PEP在水产动物中的功能性差异建立理论基础。PEP与PEPI作用机理的研究,为今后探究水产动物PEPI对PEP的调控机制提供了重要参考。