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目的:探讨华蟾素对骨癌痛大鼠的镇痛作用,并基于对骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞TAK1/JNK/c-Jun信号通路的调控,探讨华蟾素缓解骨癌痛的作用机制。方法:(1)筛选痛阈值满足条件的雌性SD大鼠30只,随机分为正常组、假手术组与模型组,正常组大鼠不作任何处理,模型组大鼠于胫骨骨髓腔内注射Walker-256乳腺癌细胞制作大鼠骨癌痛模型,假手术组大鼠于胫骨骨髓腔内注射等量的灭活的Walker-256乳腺癌细胞。各组大鼠在造模前和造模第2、5、7天检测大鼠机械痛与热痛阈值的变化,造模第7天行大鼠胫骨X线观察大鼠胫骨骨质破环情况,检测骨癌痛大鼠模型是否构建成功。模型构建成功后,将60只雌性SD大鼠,随机分为假手术组,模型组,华蟾素低(2.5 ml/kg)、中(3.75 ml/kg)、高浓度(5 ml/kg)组、假手术+华蟾素组,华蟾素各组大鼠在造模第7天开始腹腔注射不同浓度的华蟾素注射液,假手术组与模型组腹腔注射等量的生理盐水,连续给药7天。各组大鼠分别在造模前和造模第2、5、7、9、13天及单次注射华蟾素后的0.5、1、2、4、6、8、24 h检测大鼠机械痛阈值与热痛阈值,最后一次行为学检测结束后处理老鼠,免疫组化检测大鼠L4-6段脊髓星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达,Western Blot检测JNK蛋白的表达情况,免疫荧光双标检测脊髓JNK蛋白与GFAP的共定位情况,ELISA法检测脊髓细胞因子IL-1β、TNF-α、CCL2的含量。(2)选取雌性SD大鼠70只,随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)、华蟾素组(n=10)、塞来昔布组(n=10)、鞘内插管组(n=15)及JNK抑制剂组(n=15)。大鼠骨癌痛模型造模成功后,鞘内插管组与JNK抑制剂组在造模第9天开始鞘内插管。从造模第7天开始,华蟾素组大鼠腹腔注射华蟾素注射液(5 ml/kg),塞来昔布组予以一定剂量的塞来昔布灌胃,其余各组予以生理盐水腹腔注射;造模第12天,JNK抑制剂组鞘内予以JNK抑制剂(0.25μg/μl,20μl/次/天),鞘内插管组鞘内予以生理盐水(20μl,1次/天),其余各组给药方法同前。在造模前及造模后第2、5、7、9、11、13、15、17天进行为学检测。在第17天大鼠疼痛行为学检测结束后处理大鼠,Western Blot法检测GFAP、TAK1、JNK、c-Jun、p-TAK1、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达情况,ELISA法检测脊髓IL-1β、TNF-α、CCL2的含量。结果:(1)骨癌痛大鼠造模后,模型组大鼠的热痛阈值、机械痛阈值明显降低(p<0.01);予以华蟾素干预后,大鼠的热痛阈值、机械痛阈值显著升高,且具有一定的浓度依赖性,浓度越高,痛阈值越高(p<0.01 or p<0.05);在单次给药后,华蟾素在腹腔注射后6 h作用最强,而后作用缓慢减弱;但华蟾素对正常大鼠的痛阈值无影响(p>0.05)。免疫组化结果显示:模型组大鼠脊髓星形胶质细胞的活化增加(p<0.05),华蟾素能减少骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞的活化(p<0.05)。Western Blot的结果显示:模型组大鼠脊髓JNK蛋白的活化水平增加(p<0.05);华蟾素能减少骨癌痛大鼠JNK的表达(p<0.05)。免疫荧光结果显示:脊髓中p-JNK与GFAP共表达,即p-JNK的表达在星形胶质细胞。ELISA结果显示:模型组大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β、CCL2的含量明显增多(p<0.05),华蟾素能显著抑制其的释放(p<0.05)。(2)与模型组相比,华蟾素组和塞来昔布组大鼠的痛阈值逐渐上升(p<0.01 or p<0.05);生理盐水组大鼠的痛阈值未见明显变化(p>0.05);抑制剂组进行鞘内给药后,大鼠的痛阈值较生理盐水组明显升高(p<0.05);与华蟾素相比,给药早期抑制剂组痛阈值低于华蟾素组(p<0.05)。Western Blot的结果显示:模型组大鼠脊髓中GFAP、p-TAK1、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达明显增多(p<0.01);华蟾素能显著降低模型组大鼠脊髓中GFAP、p-TAK1、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达(p<0.01 or p<0.05);抑制剂组大鼠脊髓中p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达降低(p<0.05),而GFAP、p-TAK1蛋白的表达未见明显差异。ELISA结果显示:模型组大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β、CCL2的表达较假手术组明显增多(p<0.01);华蟾素组及抑制剂组脊髓中TNF-α、IL-1β、CCL2的表达较模型组明显减少(p<0.01);抑制剂组CCL2的表达较华蟾素组有所降低(p<0.05),而TNF-α、IL-1β的表达未见明显差异(p>0.05)。结论:华蟾素可能通过抑制脊髓星形胶质细胞TAK1/JNK/c-Jun信号通路相关蛋白的活化,减少TNF-α等细胞因子的释放,发挥缓解骨癌痛的作用。