论文部分内容阅读
第一部分Real-time qPCR检测大鼠Sombati难治性癫痫细胞模型中Integrin β1基因表达变化目的：整合素-跨膜系统主要介导细胞与细胞外基质的相互作用，本实验初步探讨在海马神经元的体外癫痫细胞模型中的细胞表面受体整合素β1（Integrin β1）在癫痫致痫性形成中的可能作用。方法：利用Neurobasal Medium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元，对培养至第14天的细胞，参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型，随机分为正常对照组（Control）、Sombati癫痫细胞模型组（低Mg2+），分别在用含有1mM Mg2+的pBRS液或低Mg2+的pBRS液培养细胞3h后，各组神经元在恢复维持培养基继续培养，在之后的第4天，采用Real-time qPCR方法检测Integrin β1的表达。结果：Sombati癫痫细胞造模后4天与正常海马神经细胞相比，Integrinβ1基因表达水平均明显高于正常海马神经细胞。结论：Integrin β1基因在Sombati癫痫细胞模型中表达增高，可能参与了难治性癫痫的形成过程。第二部分Integrin β1shRNA重组慢病毒载体的构建及其对Sombati难治性癫痫细胞Integrin β1基因表达的影响目的：构建Integrin β1基因RNA干扰慢病毒载体，为研究Sombati癫痫细胞模型Integrin β1的作用机制提供载体。方法:（1）针对Integrin β1目的基因序列，利用的RNA干扰序列设计软件，设计4个针对Integrin β1的RNA干扰靶点序列，构建4个shRNA慢病毒重组质粒，测序鉴定阳性克隆，常规培养HEK293T细胞，将慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进HEK293T细胞进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定，并收集病毒。（2）常规培养PC12细胞，将构建的Integrin β1shRNA1-4转染PC12细胞，分为Integrin β1shRNANC组、Integrin β1shRNA1组、 Integrin β1shRNA2组、Integrin β1shRNA3组和Integrin shRNA4组，在倒置荧光显微镜下观察，估算慢病毒感染PC12细胞的效率，并采用Western blotting检测Integrin β1shRNA系统在PC12靶细胞中的沉默效果，以筛选出沉默效果最好的其中一条Integrin β1shRNA慢病毒载体。（3）常规培养至第11天的海马神经元，分别转染Integrin β1shRNA NC和筛选出来的沉默效果最好的Integrin β1shRNA2慢病毒，继续培养至第14天，参照Sombati方法制备体外难治性癫痫模型的方法，将已经转染Integrin β1shRNANC的细胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mMMg2+的pBRS液分别培养细胞3h，同时将已经转染Integrin β1shRNA2慢病毒的细胞，用低Mg2+的pBRS液或者含有1mM Mg2+的pBRS液分别培养细胞3h，具体分组如下：正常海马神经元+Integrin β1shRNA NC、正常海马神经元+Integrin β1shRNA2、Sombati癫痫细胞模型组+Integrin β1shRNANC，Sombati癫痫细胞模型组+Integrin β1shRNA2，各组神经元均恢复维持培养基后继续培养，通过Western blotting检测其对海马神经元和Sombati癫痫细胞Integrin β1的基因沉默效果。结果：经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功，病毒达到有效滴度；Western blotting证实，重组慢病毒Integrin β1shRNA2感染海马神经元和Sombati癫痫细胞后Integrin β1蛋白表达显著下降。结论：成功构建Integrin β1RNA干扰慢病毒载体，并在新生大鼠海马神经元和Sombati癫痫细胞中实现有效的基因沉默效应。第三部分Integrin β1沉默后Sombati难治性癫痫细胞模型的FAK依赖相关信号通路蛋白表达变化目的：利用Integrin β1慢病毒载体转染Sombati癫痫细胞模型，探讨Integrin β1相关信号通路在致癫痫中的作用及其机制，为进一步阐明癫痫的发病机理提供科学依据。方法：利用Neurobasal Medium无血清神经培养基和B-27因子体外培养SD新生乳鼠的海马神经元，随机分为以下四组：正常海马神经元、Sombati癫痫细胞模型、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2，培养至第11天时，用Integrin β1shRNA NC感染Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC组的细胞，用Integrin β1shRNA2感染Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2组的细胞，至培养第14天时，参照Sombati的方法制备体外难治性癫痫模型，对Sombati癫痫细胞模型组、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA NC组、Sombati癫痫细胞模型+Integrin β1shRNA2组用低Mg2+的pBRS液培养细胞3h，恢复维持培养基，再继续培养4天，正常海马神经元组则用含有1mM Mg2+的pBRS液培养细胞3h，恢复维持培养基，再继续培养4天，各组细胞均采用Western blotting检测信号通路蛋白Phospho-FAK(Tyr397)、Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白表达水平。结果：与Sombati癫痫细胞+Integrinβ1shRNA2组相比，正常海马神经元、Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表达升高（P<0.01）；与正常海马神经元相比，Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC的Phospho-FAK水平表达升高（P<0.01），Sombati癫痫细胞和Sombati癫痫细胞+Integrin β1RNA NC组的Phospho-FAK水平无明显差异；在正常原代海马神经元、Sombati癫痫细胞模型以及转染了Integrin β1shRNA NC、Integrin β1shRNA2的Sombati癫痫细胞中，各组细胞的Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)、Phospho-PAK1(Ser199/204)/PAK3蛋白表达水平无明显变化。结论：Integrin β1在Sombati癫痫细胞中发挥作用依赖于FAK相关通路的激活，主要是启动了Tyr397磷酸化位点，但与Phospho-Rac1/cdc42(Ser71)和Phospho-PAK1（Ser199/204）/PAK3蛋白的激活无关。