地黄(Rehmannia glutinosa L.)为玄参科多年生草本植物,以块根入药,其用药历史悠久、临床疗效显著,是我国著名的道地药材。然而,地黄栽培过程中存在极其严重的连作障碍问题,连作导致地黄植株生长发育不良,病虫害严重,造成产量、品质明显下降甚至绝收,通常每茬收获后须隔8～10年后方可再种,这严重限制了中药材资源的可持续利用与发展,是构建我国现代大中药产业链亟需解决的重大课题。近年来,研究由根系分泌物介导的植物—微生物间的根际互作关系或称之根际对话机制已成为当前国内外优先研究的重要领域。本研究借助系统生物学的研究方法和技术,从土壤微生物群落结构、植物—微生物互作、植物胁迫响应等多方面多角度系统深入地阐述地黄连作障碍形成的根际生物学过程及其分子生态机制,主要研究结论如下:(1)运用土壤宏蛋白质组学技术对地黄连作下根际土壤蛋白质表达谱进行分析,鉴定到了许多来源于植物、细菌、真菌的土壤蛋白质,它们涉及多条代谢途径,如碳水化合物和能量代谢、氨基酸代谢、蛋白质合成和降解、异源物质生物降解、防御应答和次生代谢等。进一步,差异蛋白质组学分析发现,连作下地黄根际土壤中共有33个土壤蛋白质发生了差异表达。除了一个与解毒相关的蛋白质(glutathione S-transferase)下调表达外,大多数与碳水化合物、氨基酸代谢、胁迫响应以及次生代谢相关的植物蛋白质都发生上调表达。而来源于微生物的蛋白质,除一个涉及萜类化合物生物合成的蛋白质(geranylgeranyl pyrophosphate synthase)发生下调表达外,其余与蛋白质代谢、细胞壁生物合成、毒力蛋白合成相关的微生物蛋白质均上调表达。可见,地黄连作下根际微生态系统的化学生物学过程既有植物驱动,又有微生物(细菌和真菌)驱动。(2)群落水平生理指纹图谱(BIOLOG)和磷脂脂肪酸法(PLFA)分析表明,在块根伸长期和膨大期,随着连作年限的增加,土壤微生物群落结构和碳源代谢特征都发生显著变化。在块根伸长期,重茬土壤微生物的碳源代谢活性比正茬土壤高,尤其是对酸类化合物(羧酸类、氨基酸类、酚酸类)的利用,而在块根膨大期,其碳源代谢活性比正茬土壤低。这种变化趋势与土壤微生物丰度的变化趋势表现一致,即在块根伸长期,重茬1年和重茬2年土壤中的磷脂脂肪酸(PLFA)总量、革兰氏阳性菌(G+)、革兰氏阴性菌(G-)、真菌等含量都显著高于正茬土壤,而在块根膨大期,大部分PLFA含量表现出与块根伸长期相反的变化趋势。同时,发现在不同生长发育时期,重茬1年和重茬2年土壤中环丙烷磷脂脂肪酸与其代谢前体物比率(cy/pre)都显著高于对照土壤和正茬土壤,表明重茬地黄根际土壤中的微生物群落受到的生理应激压力更大。(3)末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析结果表明,连作下地黄根际土壤的细菌和真菌群落结构与功能多样性都发现明显变化,其中细菌群落的多样性指数和均匀度指数随连作年限增加而显著下降,而真菌群落的多样性指数和均匀度指数表现出相反趋势。进一步,比对数据库后发现,重茬土壤中很多属于α-变形菌门、β-变形菌门和γ-变形菌门的细菌相对含量较正茬土壤都显著降低,尤其发现假单胞菌的相对含量显著降低,而属于厚壁菌门、放线菌门和δ-变形菌门的很多细菌相对含量明显升高,同时还发现与尖孢镰刀菌或镰刀菌属相对应的一些限制性片段(T-RF)其相对含量在重茬土壤中显著上升。可见,连作导致地黄根际土壤微生物群落结构失衡,细菌多样性水平下降,有益菌数量减少而病原菌数量增多,生物互作关系脆弱。(4)运用假单胞菌选择性培养基分离筛选地黄根际土壤假单胞菌并计数统计,结果发现重茬土壤中的假单胞菌数量都低于正茬土壤,并且通过平板对峙试验发现,重茬土壤中对病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗效应的假单胞菌数量也都显著低于正茬土壤。进一步,qRT-PCR绝对定量验证分析发现,重茬土壤中假单胞菌的数量显著低于正茬土壤,而尖孢镰刀菌的数量显著高于正茬土壤,与微生物可培养法的计数结果类似,也与T-RFLP分析结果表现一致。(5)运用HPLC技术从地黄组培苗根系分泌物中共鉴定到10种酚酸类物质,包括香豆酸、3,4-二羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸、水杨酸。除了香豆酸和水杨酸外,其他8种酚酸也在地黄根际土壤中得到鉴定。模拟各酚酸在地黄根际土壤中配比的混合酚酸能够显著促进病原菌尖孢镰刀菌的菌丝生长、孢子产生以及DON毒素的产生,尤其是香草酸和阿魏酸的促进效果最强,相反,该配比的混合酚酸能够显著抑制有益拮抗菌假单胞菌W12的生长,其中香草酸和阿魏酸的抑制效果刚好最强,可见地黄根系分泌物中的主要化感物质对土壤特异微生物具有选择性促进或抑制的生态效应。同时,病原菌大量繁殖生长后其有毒代谢产物如DON毒素可进一步抑制假单胞菌W12的生长。平板对峙分析还发现,混合酚酸介导下,拮抗菌假单胞菌W12生长受抑制,并且对病原菌尖孢镰刀菌的拮抗效应减弱,造成病原菌生长繁殖更加活跃、猖獗,根际微生态结构失衡,引起恶性循环,导致地黄连作障碍问题。但是,人为干预条件下,使土壤有益拮抗菌维持一定群体数量时,能够有效防控病原菌对宿主植物的侵害,这也正面验证了拮抗菌假单胞菌W12与地黄连作障碍的密切关系以及它在缓解地黄连作障碍方面的潜力。(6)地黄块根蛋白质组学分析发现,连作胁迫对块根蛋白质表达谱变化有显著影响。连作下地黄块根由于受到了胁迫因子的影响,如病原菌侵染等,导致与胁迫响应、抵御相关的蛋白质(如 pathogenesis-related protein,cytochrome P450等)上调表达,而与块根重要生理代谢过程(如能量代谢、氨基酸、蛋白质代谢等)和块根主要成分合成相关的蛋白质(如淀粉合成、萜类合成)都下调表达,尤其发现与蛋白质折叠相关的伴侣素(chaperonin)在重茬地黄块根中全部下调表达,这造成连作地黄生理代谢过程表现异常,细胞活性下降,碳水化合物和能量代谢缓慢,而且有限的能量都用于抵御外界胁迫,块根无法正常膨大,药效成分无法积累,产量品质下降。综上可见,地黄连作导致生态系统结构简单、根际微生态结构恶化、物种多样性水平下降、生物互作关系脆弱、自我调节能力降低。反之,地下部土壤生态结构恶化导致连作植株生长发育不良,蛋白质表达异常,产生不良生理响应,最终表现典型的连作障碍症状。概括起来,造成地黄连作障碍发生的原因主要包括以下两点:(Ⅰ)由于根系分泌物的选择性抑制作用,导致土壤中具有抗病菌活性的有益菌数量随连作年限增加而明显下降;(Ⅱ)由于根系分泌物的选择性促进作用,连作下某些特异病原微生物如尖孢镰刀菌大量生长,进而侵染宿主植物。