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研究背景和目的:心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后脑损伤是心脏骤停(cardiac arrest,CA)患者复苏成功后高致死率及致残率的重要因素。心肺复苏后脑损伤实则是脑缺血再灌注损伤,而线粒体是脑缺血再灌注损伤的重要靶标。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是丝裂素活化蛋白激酶的一种,被各种应激刺激激活后,通过磷酸化多种功能蛋白来调节细胞的生长、分裂、增殖、凋亡等生理活动。我们前期研究发现:CA/CPR后大鼠脑ERK被高度激活,而应用ERK抑制剂PD98059抑制其激活能明显提高复苏后大鼠的生存率、改善脑神经功能和减少脑细胞的凋亡。这些现象的发生机制是否与缺血再灌注损伤条件下PD98059对脑细胞线粒体的结构与功能有保护作用有关,尚不清楚。本研究拟在前期工作的基础上,通过建立CA/CPR大鼠模型,重点观察PD98059对复苏后大鼠不同时间点脑组织线粒体的结构与功能的影响,探索其抑制复苏后脑损伤的分子机制。方法:将SD雄性大鼠随机分为5组:假手术组,CPR组,二甲基亚砜dimethylsulfoxide,DMSO)组,PD98059 0.15mg/kg 组,PD98059 0.3mg/kg组。除假手术组外,其余4组大鼠均应用经食道电刺激法诱导大鼠发生心室颤动、建立CA/CPR大鼠模型,在复苏成功后1min经股静脉随机给予相等容积的药物(生理盐水、DMSO、0.15mg/kg PD98059或0.3mg/kg PD98059),假手术组不用药物。复苏后24小时及48小时定为统一的观测时间点,比较各组大鼠相关指标的变化。实验分两个阶段进行:首先,从宏观层面去观察PD98059对复苏后大鼠生存率和神经功能的影响。其次,从微观层面去观察PD98059对复苏后大鼠脑皮质中线粒体结构与功能的影响以及与其相关的分子机制指标。检测指标具体包括以下几个方面:1、计算各组大鼠生存率和用神经功能缺失评分来评估各组存活大鼠神经功能受损情况。2、检测各组存活大鼠脑皮质线粒体结构与功能的指标。采用透射电镜法观察大鼠脑皮质层线粒体损伤情况;取大鼠脑皮质新鲜组织行三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)测定;采用差速离心法提取大鼠脑皮质线粒体,其后分别测定线粒体呼吸链Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性和线粒体琥珀酸脱氢酶活性。3、检测各组存活大鼠脑皮质中线粒体途径凋亡的分子指标。制作脑皮质石蜡切片,用TUNEL试剂盒测定凋亡;采用钙黄绿素荧光检测法测定脑皮质线粒体通透性转换孔(Mitochondrial membrane permeability transition pore,MPTP)的开放情况;用蛋白印迹法分别测定线粒体内及胞浆中的细胞色素C(Cytochrome C,CytC)、脑皮质组织中的BCL-2、BAX以及活化的caspase3的蛋白表达。4、检测各组存活大鼠脑皮质中与线粒体相关自噬的分子指标以及自噬与凋亡共表达情况。采用透射电镜法观察各组大鼠脑皮质层自噬标志形态;用蛋白印迹法分别测定脑皮质自噬标志物LC3、Beclin-1及P62的表达;用免疫荧光法观察脑皮质中LC3的表达以及免疫荧光双染法检测TUNEL与LC3的共表达。5、检测各组存活大鼠脑皮质中线粒体动力学蛋白的表达情况及P-DRP1分别与凋亡、自噬的共表达情况。用蛋白印迹法测定线粒体融合蛋白 2(mitofusin 2,MFN2)、动力相关蛋白 1(Dynamin-related protein,DRP1)表达;免疫组化双染法分别检测脑皮质中P-DRP1+TUNEL及P-DRP1+LC3的共表达。结果:1、生存率、神经功能评分。①生存率:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时的生存率明显下降(P<0.01,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时生存率升高,且呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.001)。②神经功能评分:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时的神经功能评分明显下降(P<0.01,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时的神经功能评分升高,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.01,P<0.001)。2、线粒体结构与功能的相关指标。①线粒体损伤评分:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质线粒体损伤评分升高(P<0.01,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质线粒体损伤评分降低,且呈剂量依赖性(PD980590.3mg/kg组:P<0.01,P<0.001)。②ATP含量:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的ATP含量明显下降(P<0.001,P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的ATP含量升高,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.001,P<0.05)。③线粒体呼吸链活性:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时脑皮质的线粒体呼吸链Ⅱ活性下降(P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时脑皮质线粒体呼吸链Ⅱ活性升高,且呈剂量依赖性(P<0.01)。④线粒体琥珀酸脱氢酶活性:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时脑皮质的线粒体琥珀酸脱氢酶活性下降(P<0.05);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时脑皮质线粒体琥珀酸脱氢酶活性升高,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.05)。3、线粒体途径凋亡的相关指标。①凋亡指数:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时的脑皮质层凋亡指数升高(P<0.001,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时的脑皮质层凋亡指数下降,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.001,P<0.001)。②MPTP孔开放情况:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质层的钙黄绿素荧光强度减弱(MPTP孔开放增多)(P<0.01,P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质层荧光强度增高(MPTP孔开放减少),且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.05,P<0.05)。③从线粒体内释放至胞浆中的CytC:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质层细胞浆中的CytC增多(P<0.05,P<0.05);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质层细胞浆中的 CytC 减少,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg 组:P<0.05,P<0.05)。④BCL-2/BAX:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质内的BCL-2/BAX降低(P<0.05,P<0.05);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质内的BCL-2/BAX升高,且均呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.01,P<0.05)。⑤活化的caspase3:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质内活化的caspase3升高(P<0.01,P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质内活化的caspase3降低,且均呈剂量依赖性(PD98059 0.15mg/kg 组:48h P<0.05;PD980590.3mg/kg 组:P<0.05,P<0.05)。4、自噬相关指标及凋亡与自噬共表达。①自噬电镜结果:各组均可见自噬存在。然而CPR组可见自噬发生的各个阶段,且在送检的所有电镜切片中CPR组可见自噬体的数量要比其他组多。②LC3Ⅱ/Ⅰ:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P<0.01,P<0.05);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的LC3Ⅱ/Ⅰ下降,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.05,P<0.05)。③Beclin-1:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质Beclin-1的表达升高(P<0.01,P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质Beclin-1的表达下降,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mg/kg组:P<0.05,P<0.05)。④P62:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质P62的表达降低(P<0.01,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的P62表达升高,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mgkg组:P<0.001,P<0.001)。⑤凋亡与自噬共表达:TUNEL+LC3免疫荧光双染中提示TUNEL阳性细胞中有着LC3的共表达。与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中TUNEL阳性细胞中有着LC3共表达的细胞数增多(P<0.001,P<0.001);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中TUNEL 阳性细胞中有着LC3共表达的细胞数减少(PD98059 0.3mgkg组:P<0.001,P<0.001)。5、线粒体动力学蛋白MFN2、P-DRP1的表达以及P-DRP1分别与凋亡及自噬共表达。①MFN2:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的MFN2表达减少(P<0.01,P<0.05);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的MFN2增多,且呈剂量依赖性(PD98059 0.3mgkg 组:P<0.01,P<0.05)。②P-DRP1:与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的P-DRP1增多(P<0.01,P<0.01);与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质的P-DRP1减少,且呈剂量依赖性(PD980590.3mgkg 组:P<0.01,P<0.05)。③P-DRP1 与凋亡共表达:P-DRP1+TUNEL免疫组化双染提示TUNEL 阳性细胞中有着P-DRP1的共表达。与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中TUNEL阳性细胞中有着P-DRP1共表达的细胞数增多;与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中TUNEL阳性细胞中有着P-DRP1共表达的细胞数减少。④P-DRP1与自噬的共表达:P-DRP1+LC3免疫组化双染中提示P-DRP1与LC3有共定位表达。与假手术组相比,CPR组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中P-DRP1与LC3共定位表达的细胞数增多;与CPR组相比,PD98059组大鼠在复苏成功后24小时和48小时脑皮质中P-DRP1与LC3共定位表达细胞数减少。结论:ERK抑制剂PD98059通过减少大脑皮质层MPTP孔开放、减少CytC的释放和调整线粒体动力学蛋白的表达,可以抑制线粒体介导的凋亡以及线粒体相关自噬的过度激活,从而维护CPR后大鼠脑皮质层线粒体功能和结构的完整性,为提高CPR后大鼠生存率及减少神经功能损伤创造了条件。本研究从细胞和分子层面上证实了 ERK通路参与了 CA/CPR后脑缺血再灌注损伤的病理生理过程,对ERK通路的抑制可以改善CPR后脑损伤。研究结果为CA/CPR后脑损伤治疗提供了一条新的思路,对ERK通路的干预有可能成为CPR后脑损伤治疗的新靶点。