鱼类非特异性细胞毒性细胞（NCC）是自然杀伤细胞（NK）进化上的前体细胞,与NK细胞功能相似,除了非特异性的细胞杀伤作用,还具有免疫调节功能,然而NCC类群及其活性调控机理尚不清楚。本文以我国南方重要的淡水养殖品种尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）为研究对象开展了三方面的研究:一、通过单细胞测序构建了罗非鱼NCC的单细胞转录图谱,鉴定出4个NCC亚群;二、通过转录组数据筛选到系列差异表达的半乳糖凝集素（Galectin）基因家族,通过酵母双杂交及GST Pull-down技术对该类蛋白与NCC受体蛋白非特异性细胞毒性细胞受体Ⅰ型（NCCRP-1）的相互作用进行了鉴定;三、针对与NCC活性调控相关的Gal-2与Gal-8开展了功能研究。取得的主要研究结果如下:1、通过高通量10x单细胞测序获得硬骨鱼免疫细胞图谱及NCC亚群信息。在对罗非鱼进行Poly I:C免疫刺激24 h后,取对照组和处理组的罗非鱼头肾并分离淋巴白细胞,通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对24,062个淋巴细胞的转录本进行了分析,构建了罗非鱼淋巴细胞图谱。根据细胞异质性和已知标志物,将头肾淋巴细胞分为B细胞、T细胞、NCC和单核/巨噬细胞（Mo/MΦ）四种类型,WGCNA预测NCC群体的调控网络,鉴定出4个中枢基因（STBD1、VWF、PGP和GRN）和1个转录因子（Hvcn1）,并根据细胞异质性和细胞内功能基因的表达,进一步将NCC鉴定出memory-like NCC、mature NCC、immature NCC和pre-NCC4个亚群。2、与NCC互作的Gals蛋白鉴定。（1）从上述单细胞测序数据中筛选差异表达的Gal基因并进行克隆,获得5个Gal基因:Gal-2（OnGal-2）,Gal-3（OnGal-3）,Gal-4（OnGal-4）,Gal-8（OnGal-8）,Gal-9（OnGal-9）,序列特征分析显示基因均无信号肽,均含有至少一个碳水化合物识别域（CRD）以及碳水化合物识别位点（V-N,H-N-R以及W-E-R）,这一结构特征与其他物种的Gal蛋白序列特征一致。（2）分别构建Gal的酵母双杂交诱饵质粒,与NCCRP-1进行互作验证,发现Gal-2可与NCCRP-1相互作用;（3）构建OnGal原核表达载体（GST标签载体）,利用percoll密度梯度方法分离NCC,通过GST Pull-down技术从NCC裂解物中钓取互作蛋白,结果显示r OnGal-2和r OnGal-8筛选鉴定到共同的胞内互作蛋白为基质金属蛋白酶（MMP）;（4）亚细胞定位分析显示MMP与OnGal-2/OnGal-8在细胞内共定位。3、分析了依赖于NCCRP-1受体的OnGal-2的免疫调节功能及其对NCC的活性调控。（1）首先通过qRT-PCR分析OnGal-2的组织分布情况,该基因分布于健康罗非鱼的组织中,其中大脑表达水平最高,其次是脾脏、肝脏、肠道、心脏、胸腺、肌肉、皮肤、头肾和鳃。无乳链球菌刺激后,OnGal-2在胸腺、头肾、脾脏以及单核/巨噬细胞的表达量显著上调,表明OnGal-2参与了罗非鱼抗菌免疫应答。（2）随后制备重组蛋白r OnGal-2（His标签蛋白）对其功能开展系列研究。体外凝集实验发现r OnGal-2对G+（无乳链球菌,海豚链球菌,巴氏葡萄球菌和格氏乳球菌）和G-菌（大肠杆菌、哈维弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌）具有凝集和结合作用,多种糖类（LPS、LTA、Gal、Man以及Mal）能削弱r OnGal-2对细菌的结合,并且r OnGal-2能够促进单核/巨噬细胞对细菌的吞噬作用;r OnGal-2可以增强NCC效应基因（Fas L、NK-lysin、Perforin和Granzyme）表达及杀伤活性。（3）双荧光素酶报告系统检测结果表明OnGal-2能够激活NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路;表明OnGal-2可能通过与MMP的结合参与NCCRP-1介导的NCC活性调控。（4）进一步的体内实验发现r OnGal-2注射至罗非鱼体内后可显著提高血清的抗菌活性（ALKP、ACP、LZM）和抗氧化能力（CAT、POD、SOD）,还能减少无乳链球菌感染后头肾、脾脏和肝脏中的载菌量、减轻组织损伤,且能调控NCC效应基因的相对表达量,从而提高感染后罗非鱼的相对存活率。4、研究了不依赖于NCCRP-1受体的OnGal-8免疫调节作用。（1）q RT-PCR分析显示OnGal-8在所有检查的组织中广泛存在,其中在脾脏中具有最高表达水平。在无乳链球菌刺激后,脾脏、头肾和脑的OnGal-8转录水平显著上调。（2）体外实验结果表明,OnGal-8重组蛋白（r OnGal-8）可以凝集红细胞、无乳链球菌和嗜水气单胞菌,结合无乳链球菌、嗜水气单胞菌和各种PAMP（脂多糖、脂蛋白、Poly I:C、肽聚糖、半乳糖、甘露糖和麦芽糖）。此外,r OnGal-8还能调节单核/巨噬细胞炎症相关基因表达、促进吞噬和呼吸爆发作用以及增强NCC的杀伤作用。（3）双荧光素酶报告基因检测结果表明OnGal-8过表达抑制NF-κB、IFN-1、STAT1以及ISRE信号通路活性,表明OnGal-8可以通过与MMP的互作参与对NCC的调控;（4）体内实验结果显示,OnGal-8过表达可通过调节血清抗菌活性（AKP、ACP和LZM）和抗氧化能力（CAT、POD和SOD）、降低感染组织中细菌的载量、减轻组织损伤以及增强NCC效应基因（CAS、FADD、Perforin1、Granzym和Fas L）表达来提高无乳链球菌感染后罗非鱼的存活率。