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目的:随着过敏原组分鉴定和抗原重组技术的不断成熟,过敏原组分诊断（Component-resolved diagnosis,CRD）已成为食物过敏诊断的重要发展方向。腰果是一种重要的树坚果过敏原,含有Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3三个主要致敏组分。本研究通过分子生物学技术,构建原核表达系统,通过大肠杆菌重组表达腰果主要过敏原,利用腰果过敏血清鉴定重组蛋白免疫学活性。通过间接ELISA方法,将重组抗原包被酶标板,优化反应条件,对腰果过敏阳性血清和阴性血清进行检验,建立腰果过敏组分诊断方法。方法:1.通过原核系统表达腰果主要过敏原Ana o 2:查询Genbank获得Ana o 2的氨基酸序列信息,利用生物信息学软件分析Ana o 2二级结构和抗原性。委托公司合成去掉信号肽后的Ana o 2序列,加入酶切位点Eco R I（GAATTC）和Xho I（CTCGAG）。将优化后的Ana o 2基因与表达载体p ET-28a（+）进行Eco R I和Xho I双酶切,回收产物后用T4DNA连接酶（DNA Ligase）进行4℃过夜连接,获得重组质粒p ET-28a（+）-Ana o 2。将重组质粒转入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,利用原核表达系统37℃IPTG诱导3 h,大量表达重组Ana o 2。将包涵体复性后获得的重组蛋白经过SDS-PAGE和质谱分析进行鉴定、利用临床上腰果过敏患者阳性血清和正常人阴性血清,通过Western blot、ELISA方法,对重组Ana o 2进行免疫学活性的评价。2.建立腰果过敏的组分诊断方法:利用间接ELISA方法,选择合适的反应方式,优化反应条件,将导致腰果过敏的3个组分蛋白分别包被酶标板,利用辣根过氧化物酶标记的羊抗人Ig E抗体作为二抗,建立腰果过敏的组分诊断方法。收集临床上符合腰果过敏症状和病史、血清总Ig E>100 k U/L、腰果s Ig E>0.35k UA/L的腰果过敏阳性血清和正常人阴性血清,分别进行检测。统计腰果过敏组分的反应频率和腰果过敏患者血清s Ig E反应异质性。根据腰果各组分蛋白s Ig E水平,通过二元Logistic回归评价各组分蛋白对腰果过敏组分诊断的影响,建立受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic curve,ROC曲线）,评价腰果各组分蛋白的诊断价值。为了进一步优化检验效能,继续通过联合变量的ROC曲线评价腰果多组分蛋白联合检测在腰果过敏诊断中的应用。结果:1.将去掉1-14 aa信号肽区域的优化Ana o 2基因构建到表达载体p ET-28a（+）,将重组质粒转化表达宿主E.coli Rosetta（DE3）,经1 m M IPTG诱导3 h后,通过SDS-PAGE鉴定在理论值54 k D大小处得到目的蛋白条带。切胶后进行质谱分析,重组蛋白分子量为51.4 k D,等电点为6.27,与目标蛋白Ana o2（Gen Bank:AAN76862.1）比对结果为通过。利用腰果过敏阳性血清和阴性血清进行重组蛋白的免疫学活性评价,Western blot结果显示重组Ana o 2与腰果过敏阳性血清有比较明显的特异性结合。ELISA结果显示重组Ana o 2-s Ig E在腰果过敏血清和阴性血清中的水平差异有统计学意义（t=2.44,P<0.05）,说明重组Ana o 2可以区分腰果过敏阳性血清和阴性血清,可作为已知抗原用于单组分-s Ig E抗体检测试剂制备。2.选择直接将单组分腰果致敏组分蛋白以1μg/m L的终浓度包被在聚苯乙烯96孔酶标板上,依次加入1:20稀释度的待测血清与1:2 000稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗人Ig E抗体,最后加入HRP底物显色的反应方式。腰果致敏组分Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3与腰果过敏血清s Ig E结合率分别为29.63%、51.85%、57.41%,三种单组分蛋白的血清s Ig E水平在腰果过敏阳性血清和阴性血清中的差异有统计学意义（χ2=9.385,P<0.05）,在性别之间差异没有统计学意义（χ2=0.394,P=0.831）。建立ROC曲线可得,Ana o 3的曲线下面积（Area Under Curve,AUC）为0.922,成为在腰果过敏单组分诊断中最主要的指标;采用多组分联合诊断AUC均高于使用单一组分检测,当同时使用三种组分联合诊断时,AUC可达0.969,对于腰果过敏阳性血清检出效果最好。结论:1.利用原核系统成功表达了重组Ana o 2,产量和纯度较高,与腰果过敏患者血清具有良好的反应性,并能很好地区分腰果过敏阳性血清和阴性血清,为腰果过敏组分诊断提供了有用的抗原原料。2.利用腰果单组分蛋白,通过间接ELISA,建立了腰果过敏的组分诊断方法。对腰果单组分蛋白反应率和腰果过敏患者的s Ig E异质性进行了分析。通过建立ROC曲线评价了各组分蛋白在腰果过敏诊断中的价值,多组分联合诊断腰果过敏可进一步提高检测效率。