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油菜素内酯（Brassinosteroid,BR）是植物特有的甾醇类激素,普遍存在于植物的各个组织中。BR是继五大激素后,被发现的一种内源性植物激素,生理活性远高于其他激素,较低浓度即可调控植物生长发育的各个方面。自BR被发现后,其信号通路及转导途径被深入研究。BR被其受体BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）识别接收后,通过级联反应被传递至细胞内,刺激其共受体BAK1（BRI1-association receptor kinase1）形成二聚体,再通过级联反应调控BES1/BZR1的磷酸化或去磷酸化。磷酸化的BES1/BZR1进入细胞质后被蛋白酶体降解,而去磷酸化BES1/BZR1进入细胞核调控下游靶基因表达,进而调控植物的生长发育。研究表明,BES1/BZR1直接或与其他转录因子形成复合体后结合下游相关基因启动子区域的E-box或BRRE元件来调控这些基因的表达。在课题组前期研究中,我们鉴定到10个玉米Zm BES1/BZR1s成员。其中,Zm BES1/BZR1-5除N端含有一个高度保守的BES1结构域外,在C端还有一个β-淀粉酶结构域（BAM）,暗示其功能及作用机制可能不同于其他Zm BES1/BZR1成员。因此,本研究通过生物信息学分析、亚细胞定位、蛋白结构特性、实时荧光定量PCR（Real time quantative PCR,RT-q PCR）、拟南芥突变体互补、水稻和玉米的过表达及玉米突变体分析等实验,对其特性及功能进行分析。随后,通过酵母文库筛选、酵母双杂交（Yeast two hybrid,Y2H）、双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC）、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IPseq）、酵母单杂交（Yeast one hybrid,Y1H）及双荧光素酶（Luciferase assay）等实验,对其上下游调控的组份进行鉴定。为玉米Zm BES1/BZR1s调控非生物胁迫及籽粒大小研究奠定基础。取得主要结果如下:1.Zm BES1/BZR1-5基因编码序列全长1956 bp,编码651个氨基酸,有10个外显子和9个内含子,启动子区域含有多个顺式作用元件。Zm BES1/BZR1-5蛋白N端具有典型的b HLH结构域（BES1结构域）,与拟南芥及水稻BES1/BZR1高度保守。同时,其C端包含1个糖苷水解酶家族14的β淀粉酶（BAM）结构域,与拟南芥BAM7,BAM8及水稻BAM同源性较高。2.Zm BES1/BZR1-5无论在洋葱表皮、烟草叶片和玉米原生质体中,均定位于细胞核。而b HLH结构域定位于细胞核和细胞质、BAM结构域定位于细胞质中。Zm BES1/BZR1-5全长、b HLH及BAM结构域均无转录激活活性,但Zm BES1/BZR1-5自身能够形成多聚体,且BAM是形成多聚体所必须的结构域。3.Maize GDB数据库中检索到Zm BES1/BZR1-5在玉米不同组织和不同发育时期均有表达且参与非生物胁迫。Zm BES1/BZR1-5的表达受到渗透和盐胁迫及ABA处理的诱导。在盐胁迫处理下,其在叶片中处理9h后显著上调表达,而其他时间表达不显著;根部除了9h差异不显著,其他时间点均下调表达。而在PEG6000条件下,Zm BES1/BZR1-5总体上下调表达,其中在1、3、6、9h在叶片中差异显著;根部所有时间点均显著下调表达。在脱落酸（Abscisic acid,ABA）处理下,Zm BES1/BZR1-5在叶片中均为显著上调表达,而在根部中均显著下调表达。4.通过拟南芥突变体互补进一步验证Zm BES1/BZR1-5正向调控干旱、盐胁迫以及响应ABA。转基因株系在正常条件下生长无明显差异,而在模拟盐、干旱胁迫和ABA处理下,根长及鲜重显著高于对照组。此外,盐胁迫和干旱胁迫下丙二醛含量（MDA）和相对电导率（REL）显著低于对照,表明转基因株系膜损害程度较小。转基因拟南芥转录组分析共得到84个差异表达基因（DEGs）,KEGG分析显示所有差异表达基因参与次生代谢及其生物合成。其中有30个基因直接响应胁迫,这些基因启动子含有2-15个E-Box不等,极个别含有BRRE。Y1H确定Zm BES1/BZR1-5能够直接结合E-box,并可以直接结合到同时响应干旱、盐胁迫及ABA的基因AT3G05880（RCI2A）的启动子上。5.Zm BES1/BZR1-5除了调控非生物胁迫外,还能调控籽粒大小。关联分析筛选到四个SNP（Single nucleotide polymorphisms）与百粒重相关,三个SNP与粒宽相关,其中一个与粒宽相关的SNP位于Zm BES1/BZR1-5的启动子区域。在拟南芥、水稻及玉米过表达中,过表达株系粒长、粒宽及千粒重均显著大于对照。两种不同类型的玉米突变体籽粒显著小于野生型。以上结果表明,Zm BES1/BZR1-5能够增加种子长宽及重量。同时,拟南芥互补和过表达水稻还呈现提前开花表型,使植物从营养生长提前进入生殖生长。6.Zm CKIIβ4（Zm00001d03500）和Zm Fdx2（Zm00001d02155）是Zm BES1/BZR1-5的上游互作蛋白。通过Y2H和Bi FC验证,进一步发现Zm CKIIβ4只能与Zm BES1/BZR1-5全长蛋白互作,而Zm Fdx2与Zm BES1/BZR1-5全长蛋白及其b HLH结构域互作,与单独的BAM结构域不互作。同时,Zm CKIIβ4定位在细胞核和细胞质中,而Zm Fdx2仅定位至细胞质中。7.Zm BES1/BZR1-5的靶基因是AP2/EREBP类基因Zm00001d010676和Zm00001d032077。酵母单杂交实验证明Zm BES1/BZR1-5能够结合这两个基因的启动子。荧光素酶实验进一步证实Zm BES1/BZR1-5能够直接结合这两个基因的启动子并抑制其表达,从而调控籽粒大小。