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透明带（zona pellucida,ZP）蛋白是由ZP基因家族编码的构成动物卵子和早期胚胎外膜的一类糖蛋白。这种细胞外膜在生物体内起着非常重要的构造功能,并且在卵子的形成、卵细胞的受精和胚胎的发育过程中起着非常重要的生理生化作用。随着分子生物学技术方法的快速发展,ZP蛋白的组成、形成过程和生理功能都得到了较深入的研究。然而,随着越来越多的ZP蛋白从不同物种中克隆分离出来,到目前为止尚缺乏一个统一的ZP基因命名体系,且关于脊椎动物全基因组尺度ZP基因的鉴定也有待开展。此外,ZP蛋白的表达在四足类已比较清晰,在不同类群中得到了较一致的研究结果。然而,ZP蛋白在鱼类中数量繁多,表达情况比较复杂,不同物种ZP蛋白的组织表达差异较大,迄今尚未得到明晰而一致的结果。本研究对脊椎动物的ZP基因开展了全基因组范围的鉴定,并试图为脊椎动物的ZP基因建立一个具有较好流行性、通用性和简约性的命名体系。同时,对尼罗罗非鱼的7个不同组织,以及4个不同发育阶段性腺的ZP基因表达模式作了转录组水平上的分析。通过RT-PCR和原位杂交验证尼罗罗非鱼ZP基因的组织分布及其在不同组织中的细胞定位;分析了dax1和42Sp50纯合突变尼罗罗非鱼卵巢的ZP基因表达。此外,研究了雌二醇和芳香化酶抑制剂分别诱导的XY和XX性逆转尼罗罗非鱼ZP基因的表达,以及雌二醇、甲基睾酮和芳香化酶抑制剂letrozole对离体孵育肝脏和性腺ZP基因表达的影响,为进一步研究ZP基因的功能奠定基础。具体研究结果如下:1脊椎动物ZP基因的分离鉴定在七鳃鳗、象鲨、腔棘鱼、斑点雀鳝、斑马鱼、尼罗罗非鱼、青鱂、三棘刺鱼、花鳉、剑尾鱼、海马、乌鳢、墨西哥脂鲤、黑青斑河豚、爪蟾、中华鳖、鸡、鸭嘴兽、袋鼠和人的基因组中发现了16,9,17,27,21,19,20,26,14,11,24,17,9,18,8,11,9,8,5和4个ZP基因。脊椎动物ZP基因的数量从低等到高等,从水生到陆生,从卵生到胎生的进化过程中,总的趋势是逐渐减少,且与卵子受精和胚胎发育的环境有关。2 ZP基因家族的系统进化分析用氨基酸序列构建脊椎动物ZP基因系统发育树。结果表明,脊椎动物ZP基因可以分为5个亚家族:ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。ZPA存在于除软骨鱼类和真骨鱼类之外的脊椎动物。ZPB和ZPC亚家族存在于所有脊椎动物类群中。ZPD存在于除圆口类、墨西哥脂鲤、后兽类和真兽类外的脊椎动物。ZPAX基因存在于真兽类之外所有脊椎动物。ZP基因的命名遵照系统发生的层级制度:首先,亚家族（大写字母）;然后,一级旁系标签（阿拉伯数字）;再后,二级旁系标签（小写字母,如必要）;最后,串接标签（短线-阿拉伯数字）。3 ZP基因在尼罗罗非鱼7个组织中的表达模式分析通过对性成熟尼罗罗非鱼7个组织（脑、心脏、肝脏、精巢、肾脏、头肾和卵巢）的转录组表达谱分析发现,19个ZP基因中有2个（ZPB1a和ZPB2c）在7个组织中均处于本底表达,有2个（ZPB2b和ZPC2）仅高表达于肝脏中,剩余的15个都高表达于卵巢中,在其他组织中基本处于本底表达状态。4 ZP基因在尼罗罗非鱼组织分布的RT-PCR验证RT-PCR验证分析表明,ZPB2b和ZPC2在XX成鱼的肝脏高表达,而ZPAX1、ZPAX4、ZPC5-1和ZPC5-2则在卵巢高表达,该结果与转录组分析结果一致。5 ZP基因在尼罗罗非鱼不同发育时期性腺转录组中的表达模式分析在尼罗罗非鱼的19个ZP基因中,ZPB1a、ZPB2b、ZPB2c、ZPC2和ZPAX2在性腺发育的所有阶段中均不表达。剩余的14个ZP基因在孵化后5天（days after hatching,dah）的性腺中表达量低,在30 dah开始在卵巢中表达,在90和180 dah时卵巢中高表达,且表达量（RPKM值）均高于100。6 ZP基因表达的原位杂交验证通过原位杂交（In situ hybridization,ISH）对尼罗罗非鱼ZPC2在肝脏、ZPC5-2、ZPAX1在卵巢的表达进行验证,同时也可对表达的细胞类型进行定位。ISH结果显示:ZPC2在肝脏的肝血窦内皮细胞中表达,但在卵巢中不表达;ZPC5-2在卵巢的I和II时相卵母细胞中表达,而ZPAX1在卵巢I、II和III时相的卵母细胞中均有表达,但二者在肝脏中均未见表达。7 ZP基因在dax1和42Sp50纯合突变鱼卵巢中的表达利用实验室构建的dax1和42Sp50纯合突变鱼性腺转录组测序结果,分析了缺失Dax1和42Sp50对ZP基因表达的影响。发现在30 dah时,由于性腺中仅见卵原细胞,而对照组却拥有卵原细胞和大量I时相卵母细胞,dax1-/-卵巢中所有ZP基因的表达均低于对照卵巢。相反,在180 dah时,42Sp50-/-卵巢仅有I和II时相卵母细胞,而对照卵巢中大量II时相卵母细胞已发育至III、IV时相,因此,所有ZP基因在42Sp50-/-卵巢中的表达均高于对照卵巢。可见,ZP基因的表达水平与卵巢中I、II时相卵母细胞数目明显相关。8雌激素对尼罗罗非鱼ZP基因表达的影响利用实验室前期完成的雌二醇（E2）处理诱导的XY雌鱼、芳香化酶抑制剂fadrozole处理诱导的XX雄鱼的性腺转录组测序结果,分析300 dah性腺中ZP基因的表达,发现E2诱导的XY雌鱼ZP基因的表达均高于XY对照组,而fadrozole诱导的XX雄鱼ZP基因的表达均低于XX对照组。同样,用E2处理离体培养的XY雄鱼肝脏和精巢,能显著上调ZP基因的表达,而用甲基睾酮（MT）和芳香化酶抑制剂letrozole分别处理离体培养的XX雌鱼肝脏和卵巢,均能显著下调ZP基因的表达。这些结果表明,在尼罗罗非鱼,ZP基因的表达受到雌激素水平的影响。综上所述,本研究采用了适合所有脊椎动物ZP基因的命名体系。脊椎动物ZP基因可以分为5个亚家族,分别为ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。脊椎动物从低等到高等,从水生到陆生,从卵生到胎生的进化过程中,ZP基因的数量总的趋势是逐渐减少。尼罗罗非鱼共有19个ZP基因。其中,ZPB1a和ZPB2c在不同组织和不同发育阶段的性腺均未见表达,ZPB2b和ZPC2在肝脏特异性高表达,其余均在卵巢中表达,且主要表达于I、II时相的卵母细胞。无论是肝脏还是性腺表达的ZP基因均受到雌激素的影响。总之,本文全面鉴定了脊椎动物的ZP基因,研究了该家族成员的表达模式,为开展该基因在脊椎动物进化中的功能研究奠定了基础。