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目的:构建针对人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体,感染U87-MG细胞,观测其沉默TRPV1基因的效果。通过沉默TRPV1基因观测利多卡因处理后对U87-MG的细胞状态和凋亡情况的影响,以探讨利多卡因是否通过TRPV1产生神经毒性损伤。方法:利用Ambion在线设计软件设计针对人TRPV1基因的sh RNA干扰序列,克隆到p SUPERretro-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量PCR及Western blotting法检测TRPV1表达。U87-MG的细胞分为空白对照组、基因沉默组以及空载体组。对于每个组的细胞,我们利用流式细胞技术,研究利多卡因处理后不同时间点的细胞内钙离子浓度及线粒体膜电位情况。并通过MTT方法和流式细胞术,检测U87-MG细胞的活力和凋亡情况。结果:经DNA测序和酶切鉴定表明,p SUPERretro-puro TRPV1表达载体构建成功。p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显降低。U87-MG细胞活力随着利多卡因处理浓度增高而降低。利多卡因处理各组细胞后随着时间增加,细胞内钙离子浓度逐渐上升。TRVP1基因沉默组的各时点钙离子浓度显著比其他各组低(P<0.05)。利多卡因处理后,对照组U87-MG细胞的线粒体膜电位明显下降,而在TRVP1基因沉默组线粒体膜电位较高(P<0.05)。同时,流式细胞结果显示,利多卡因处理后,各组的细胞凋亡增高,而在TRVP1基因沉默组则明显低于对照组(P<0.05)。结论:成功构建了针对人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1表达载体。p SUPERretro-puro TRPV1能有效下调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达。利多卡因可导致U87-MG细胞内钙离子浓度增高,线粒体膜电位降低和细胞凋亡增多。同时,沉默TRPV1基因可降低利多卡因的这些损伤作用。这提示TRPV1与利多卡因神经毒性损伤机制有关。利多卡因可能通过激活TRPV1通道蛋白来增加细胞内钙离子浓度,降低线粒体膜电位并介导细胞凋亡。