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研究背景和目的CO是无色、无味、无臭的气体,日常生活中通风条件差情况下易中毒,常见来源是煤炉产生的煤气或者液化气管道泄漏气或者工业产生煤气。急性CO中毒是由于吸入高浓度CO后引起的主要是脑和心脏等主要器官缺氧性疾病。其中急性一氧化碳中毒迟发性脑病(delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide, DNS)是最严重的并发症,是患者在急性一氧化碳中毒后的一短时间正常或者接近正常的假愈合期后,出现记痴呆,锥体外系或者精神症状为主要表现的神经系统疾病。国内外发病率很高,尚无理想临床治疗方式,一直成为临床和基础研究热点。目前,DNS发病机制不是很明确,可能一氧化碳中毒后缺血缺氧机制,细胞毒性损伤机制,细胞凋亡机制,免疫机制、缺血再灌注损伤机制和氧化应激等有关,尤其是氧化应激和细胞凋亡。缺氧,供氧以及高压氧治疗过程中大量氧自由基产生,加神经细胞含有大量不饱和脂肪酸,易导致神经元细胞死亡或者启动细胞凋亡程序。CO中毒后脑组织内炎症因子水平升高和胶质细胞浸润,免疫炎症成为研究DNS机制的重点,并更能合理解释DNS的假愈合期。氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性气体,氢气的溶解度比较低,且不能被机体大量吸收,所以,人们一直认为氢气属于生理性惰性气体。2007年日本学者报道,。氢气能够选择性的清除羟自由基和亚硝基阴离子,氢气具有的选择性抗氧化作用,可有效治疗脑缺血再灌注损伤。随后我的研究证明,氢饱和生理盐水可明显减轻新生儿脑缺血损伤后神经细胞凋亡。氢气作为一种新的抗氧化剂,可选择性清除自由基,抑制炎症,抗凋亡,因此,提出氢气是否对于治疗DNS有效,本实验建立CO中毒迟发性脑病动物模型,目的验证氢气治疗减少CO迟发型脑病的推测,检测氧化,凋亡,炎症指标评估饱和氢生理盐水对DNS治疗的有效性。同时,建立原代海马神经元缺氧复氧模型,在细胞水平,研究含氢培养基对缺氧复氧后原代海马神经元的凋亡抑制作用。第一部分、一氧化碳中毒迟发性脑病动物模型的建立方法:1、急性静态吸入CO法建立急性CO中毒迟发性脑病模型(高压舱内CO气体浓度达到1000ppm,维持40min,后CO浓度达到3000ppm,约20min,至大鼠出现昏迷)。2、观察SD大鼠中毒过程中表现。3、通过水迷宫检测,CO中毒后SD大鼠不同时间点记忆力变化。结果:1、CO中毒约20min后SD大鼠出现轻度活跃,烦躁不安的表现。随后30-40min SD大鼠表现明显烦躁不安,跳跃,呼吸急促,幅度增大,口腔黏膜及肢体末端出现明显樱桃红色,CO浓度达到3000ppm时,SD大鼠躁狂,不能行走,甚至角弓反张,继而出现四肢瘫痪,昏迷。2、CO中毒后第7、9天CO中毒组潜伏期长于空白对照组,有统计学意义。第二部分、氢饱和生理盐水对一氧化碳中毒迟发型脑病的治疗作用方法:1、经典大鼠CO中毒迟发性模型的建立。2、Morris水迷宫检测在不同处理组认知功能的差异。3、CO中毒后9天,4%多聚甲醛固定大鼠,取脑,尼氏染色观察皮层和海马神经元的形态学改变。4、检测氧化应激指标MDA和SOD在脑组织匀浆中的表达。5、TUNEL染色及caspase-3酶活性检测神经元凋亡的变化。6、免疫荧光方法检测脑中小胶质细胞激活情况(Iba1的表达水平),以及免疫组化检测髓磷脂蛋白(MBP)在皮层和海马中的表达。7、ELISA法检测皮层和海马TNF-a、IL-1b和8-OHdG表达。结果:1、水迷宫检测结果,提示饱和氢生理盐水治疗可以明显减少CO中毒导致的认知功能减退。2、氢饱和生理盐水组治疗皮层和海马CA1区尼氏阳性细胞明显减少。3、氢饱和生理盐水可提高CO中毒后脑内SOD活性,降低MDA含量,增强抗氧化能力。4、氢饱和生理盐水可以抑制caspase-3活性,减少细胞凋亡。5、氢饱和生理盐水治疗可以有效减少CO中毒后大鼠脑中小胶质细胞特异性抗原Iba1的表达,同时降低髓鞘蛋白(MBP)降解亦。6、与对照组比较,氢饱和生理盐水可明显抑制大脑海马和皮层中TNF-a、IL-1b、8-OHdG的表达降低。第三部分、含氢培养基抗缺氧复氧后海马经元凋亡的研究方法:1、原代海马神经元体外培养。2、海马神经元缺氧复氧模型(缺氧60min,复氧24h)。3、免疫组化检测鉴定海马神经元纯度。4、海马神经元OGD处理24h,MTT法测定不同处理组细胞存活率。5、丙二醛(MDA)含量和细胞外液乳酸脱氢酶(LDH)释放量测定海马神经元损伤程度。6、 TUNEL染色检测海马神经元凋亡的变化以及caspase-3酶活性检测7、Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax, Bcl-2的表达。结果:1、第8天海马神经元NSE和DAPI染色显示,海马神经元阳性细胞率(94.2±2.1)%。2、与模型组对比,含氢培养基组明显提高细胞存活率。3、含氢培养基治疗可减少LDH释放,降低MDA含量。4、含氢培养基可以抑制caspase-3活性,减少细胞凋亡。5、含氢培养基可抑制凋亡相关蛋白BAX表达,提高BCL-2水平。小结1、腹腔注射饱和氢生理盐水可显著改善大鼠一氧化碳中毒迟发性脑病。为临床上DNS治疗提供一种新方法。其作用机制可能与氢气的抗氧化抗炎,抗凋亡作用相关2、在细胞水平,含氢培养基抑制缺氧复氧损伤后海马经元凋亡的作用,进一步证明氢气抗凋亡作用。3、氢气作为一种新的医学气体,具有选择抗氧化,抗凋亡,抗炎作用。为临床上氧化损伤疾病提供新的治疗手段。