布氏杆菌病(Brucellosis)简称布病，由革兰氏阴性菌属布氏杆菌侵入机体后引发的变态反应性传染性人兽共患病，感染途径较多，人群普遍易感，感染后不易治愈，世界范围内均有分布，在《中华人民共和国传染病防治法》中该病被规定为乙类传染病。布病的流行严重影响经济的发展和居民的健康，因此该病的防治尤为重要。布病缺乏特异性的临床表现，实验室检测方法成为鉴别诊断布病的主要依据，传统实验室检测方法特异性较低，单克隆抗体因具有较高的特异性，而成为鉴别诊断布病的主要手段之一。目的：制备特异性较高的单克隆抗体，应用于布氏杆菌与其他革兰氏阴性菌（如鼠伤寒沙门菌、耶尔森氏菌O:9、大肠杆菌O157、单增李斯特菌）的鉴别诊断，为本课题组后期实验奠定基础，并进一步应用于吉林省松原地区流行株的检测，为当地布病的早期诊断提供可靠的实验室依据。方法：采用方阵滴定法优化选择最佳包被浓度，在此基础上确定酶标记山羊抗鼠抗体最佳工作浓度，建立灵敏性较高的间接ELISA。将羊种布氏杆菌M5悬液与弗氏完全佐剂或弗式不完全佐剂充分混匀，免疫接种健康雌性BALB/c小鼠。采用间接ELISA筛选效价较高小鼠，取其脾脏研制脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞5:1比例进行细胞融合，并用有限稀释法对阳性融合细胞进行亚克隆，至连续两次克隆阳性率为100%。采用体内诱生法制备单克隆抗体腹水。饱和硫酸铵和AKTA蛋白纯化仪对单克隆抗体进行纯化，SDS-PAGE电泳分析检测纯化效果并检测纯化前后抗体的效价。对单克隆抗体进行特异性坚定、亚型鉴定及稳定分泌抗体能力的检测。采用已建立的间接ELISA对单克隆抗体与松原市分离株的交叉反应进行检测。结果：确定了包被抗原最适宜浓度1:10及酶标记山羊抗鼠抗体的最佳工作浓度1:4000，建立了灵敏性较高的间接ELISA法。通过细胞融合获得了不与羊种、猪种等部分布氏杆菌及部分革兰氏阴性菌发生交叉反应，特异性较高的且能稳定分泌羊种布氏杆菌单克隆抗体的细胞株6D3，对单克隆细胞株进行亚类鉴定为IgG3，SDS-PAGE电泳分析检测纯化效果经33%、50%饱和硫酸铵粗提的腹水中单克隆抗体前后变化不明显，粗提后效价均为1:640，电泳仍存在有很多杂蛋白带，经蛋白纯化仪纯化后的单克隆抗体，非特异条带消失，两条目的条带清晰干净，重链位于46KD与58KD之间，轻链位于25KD左右，纯化后抗体效价为1:1280。10株临床分离株经MLVA分析，8株聚类到羊2型，只有S95及S178株聚类到M5分支，6D3分泌的单克隆抗体与10株分离株中的S95交叉反应结果呈阳性，其P/N值为15.67，其他均呈阴性；与另外12例分离株中的S476交叉反应结果呈阳性，其P/N值为7.43，其余均呈阴性。结论：应用杂交瘤技术获得特异性较高且能稳定分泌羊种布氏杆菌单克隆抗体的细胞株6D3，不仅可将羊种布氏杆菌与猪种、牛种布氏杆菌区分鉴别，还可用于布氏杆菌与其他革兰氏阴性菌的鉴别，为布病的实验室检测提供了可靠依据。单克隆抗体初步应用于吉林省松原市22株分离株的检测，只与其中的S95及S476两株分离株交叉反应结果呈阳性，具有型特异性，可用于病原检测。