类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎、破坏性关节病变为主要特征的慢性、自身免疫性疾病,致畸、致残率极高。对于RA至今尚无特效疗法,东北农业大学生命科学学院生物制药教研室正在研发的治疗RA的重组基因工程抗体药物,是以抗引起RA主要致炎因子IL-1β,IL-17为靶标的双价抗体药物,它的研制成功将填补国内治疗RA疾病的双价抗体药物的空白,缩短我国生物制药与世界总体制药水平的差距。为了保证生物技术药物的安全,有效和质量监控,需要进行临床前药理学的研究,动物模型的构建则是其中最为重要的组成环节之一,本研究的首要目的是建立能较全面反映RA特点的动物疾病模型。IL-1β在RA炎的发病进程中的主要作用机理已经得到了明确的阐述,主要是使滑膜细胞和软骨细胞合成和释放胶原酶和其他蛋白溶解酶,并抑制软骨细胞合成蛋白多糖基质,从而在RA炎的发病进程中起重要作用;而近年来在RA病人滑膜上清液中发现大量存在的具有生物活性的IL-17,能显著促进炎症细胞分泌TNF-α、IL-1β,与其他炎症细胞因子有协同作用,间接促进RA炎症的发展。而多聚蛋白聚糖酶,即带有血小板凝血酶原敏感基序的解整连素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS) ADAMTS-4对RA疾病中细胞外基质蛋白聚糖的降解起着重要的作用。在构建动物模型的基础上,本研究将通过IL-17诱导体外培养的软骨细胞,检测ADAMTS-4的表达情况,深入的研究IL-17在RA疾病中的是否在关节局部发挥直接作用,以期进一步探讨RA在分子水平的发病机理,更好的为创新药物的临床前药理学研究提供基础。首先建立类风湿性关节炎动物模型,方法为:45只SD大鼠随机分成3组:免疫诱导组,免疫诱导加寒湿刺激组和对照组。免疫诱导组用鸡Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂乳化混合后0.25mL注入大鼠足跖部和背部皮下,7d后以0.1mL乳化剂加强免疫一次。寒湿刺激组在免疫诱导的基础上,每天将大鼠放入冰水中1h,连续14d。以相同体积的溶剂冰醋酸注射做为对照组。诱导后每周测量大鼠体重和足爪肿胀程度,21d和42d分别采集大鼠血清,测定抗Ⅱ型胶原抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17表达水平,并对踝关节进行组织病理学、X-ray放射学检查。成功建立RA的整体动物模型后,本研究进一步采用体外试验研究法,从分子水平单因素的考察IL-17在关节局部的致病作用,首先以胰蛋白酶和胶原酶两步消化法无菌取得大鼠软骨细胞,然后进行体外培养,经IL-17诱导后,在不同的时间点采集细胞样品,从蛋白质水平分析RA中IL-17能否诱导破坏软骨基质重要酶ADAMTS-4的表达,再从基因水平检测ADAMTS-4表达量的变化。具体试验方法为:将体外培养软骨细胞分为二组,即IL-17诱导组和未诱导对照组,分别取24h,48h的细胞培养上清液,离心后,采用蛋白质免疫印迹法检测ADAMTS-4蛋白质的表达情况,采用实时定量PCR法检测ADAMTS-4的mRNA的表达量的变化。首先采用Trizol法提取软骨细胞RNA,紫外分光光度仪测定RNA的OD值,并进行琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量。将质量合格的RNA逆转录为cDNA,采用PCR扩增ADAMTS-4片段,经琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察PCR扩增结果。分别对两个时间点IL-17处理组软骨细胞与未处理组软骨细胞的cDNA在ABI 7500 real time PCR仪上进行实时定量PCR扩增,同时对每个样品做内参GAPDH的扩增。每个样品重复检测3次,用2-△ΔCt相对定量法分析其mRNA转录改变。制备的类风湿性关节炎动物模型显示,试验大鼠在免疫后,足爪在次日严重红肿,随后肿胀逐渐消退,第7天加强免疫之后,双侧后足爪肿胀明显,前爪也发生继发性肿胀。胶原诱导组发病率为80%,胶原诱导加寒湿刺激组发病率为85%,溶剂对照组没有发病。与对照组相比,两个模型组间血清中抗CⅡ抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17的水平均升高,差异极显著(P<0.01),而两个模型组的大鼠血清中抗CⅡ抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17水平相比较,胶原诱导加寒湿刺激组比单纯诱导组稍有升高,但是差异不显著(P>0.05)。对照组的大鼠踝关节组织切片可见清晰的关节腔,而两个模型组大鼠踝关节组织切片可见滑膜细胞增生,排列疏散,紊乱,软骨细胞增生,关节腔可见炎性细胞浸润,滑膜组织中淋巴细胞严重浸润。发病大鼠踝关节处X光片的骨关节边缘模糊、软骨破坏、骨变形。采用胰蛋白酶和胶原酶两步消化法成功获得原代的软骨细胞,对软骨细胞进行传代培养后,细胞生长状况良好,软骨细胞经冻存复苏后,活细胞率可以达到87%。经蛋白质免疫印迹分析表明,无论是经IL-17诱导还是未诱导组的软骨细胞均分泌表达ADAMTS-4蛋白,以Trizol法提取软骨细胞中的总RNA经鉴定纯度较好,经逆转录获得的cDNA为模版,以ADAMTS-4的上下游引物进行PCR扩增,可获得约99bp的预期长度的产物片段,条带清晰,无杂带。实时定量PCR检测致炎细胞因子IL-17诱导体外培养软骨细胞的ADAMTS-4的转录水平,发现破坏软骨细胞基质的ADAMTS-4的mRNA转录水平在诱导后24h和48h均显著升高,分别升高了6.37,8.62倍,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。通过对临床症状、关节炎指数、抗CⅡ抗体滴度、致炎细胞因子水平、组织病理变化和影像学变化的综合指标评价,本研究成功建立了大鼠类风湿性关节炎疾病模型,为创新药物的临床前研究奠定了基础。在RA整体动物模型中,以ELISA方法检测发现发病大鼠血清中IL-1β、IL-17的水平与对照组相比显著升高,说明创新药物构建的双价抗体以这两种致炎因子为靶标,将会有效的阻断RA的炎症进程。由于本研究旨在为抗IL-1β、IL-17双价的基因工程抗体药物的临床前药理学研究提供基础,考虑到整体动物模型体内环境复杂,为排除各种其他因素的干扰,本研究在体外进行软骨细胞的培养,通过进一步的体外试验研究表明,IL-17诱导组与未诱导组的软骨细胞培养上清液中均可以检测到ADAMTS-4蛋白的表达,实时定量PCR分析结果表明IL-17诱导组软骨细胞ADAMTS-4的表达量明显升高,与未诱导组的差异显著,可以推测在RA患者体内IL-17除了可以通过促进炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌,间接促进炎症发展以外,它还可以在关节局部直接通过诱导软骨细胞分泌ADAMTS-4来降解软骨中的蛋白聚糖,破坏软骨基质,使RA患者关节局部发生畸形,甚至残疾,从而在RA病症进程中发挥间接和直接的重要作用,可以推测阻断IL-17的作用是RA治疗中的一个潜在作用靶点,有可能成为有效筛选治疗RA有效药物的方式之一。