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目的：
SHP-2是一个进化上相对保守的蛋白酪氨酸磷酸酶,由PTPN11编码的SHP-2也是非受体蛋白酪氨酸磷酸酶中的一员,并且被认为参与许多细胞因子和生长因子信号转导过程的激活。在细胞浆中细胞信号传导通路激活后,SHP-2是信号通路的下游受体。SHP-2作为细胞传导通路中负调节因子,可以刺激细胞增殖和分化。
超过99%子宫颈癌病例是HPV感染的结果,大约70%是HPV16/18感染所致。尽管HPV感染与宫颈癌有因果关系存在,但确切机制仍不清楚。在病毒激活的免疫反应中,SHP-2常会伴随出现,一般认为SHP-2是这类免疫反应的负性调节因子。SHP-2还可能抑制T细胞和B细胞的活化。由以前的研究可知,SHP-2抑制TRIF依赖的Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)和炎症细胞因子的产生,故在宫颈组织中SHP-2也作为负调节因子发挥作用。
目前,宫颈癌的发生发展机理还不十分清楚,预防和治疗手段远非完善,治疗效果也不尽如人意。为了探讨宫颈癌患者SHP-2的表达是否有变化,研究SHP-2与HPV感染之间的关系,本研究选取45例宫颈癌患者,32例宫颈上皮内瘤变患者(CIN),14例正常宫颈进入本研究。本研究从宫颈组织、血液及细胞三个水平检测HPV感染相关的宫颈病变中免疫调节因子SHP-2的表达状况,HPV感染状况及IFN-B等细胞因子变化,可以明确SHP-2与HPV感染相关的宫颈病变的关系,以期证实HPV感染的宫颈癌患者中SHP-2高表达,两者之间有相关性。HPV感染后通过SHP-2负调控IFN-β信号通路,抑制IFN-β的产生,最终导致宫颈癌的发生。
方法：
一、SHP-2在宫颈病变组织中的表达及其与HPV感染的关系
1、样本选择
选择中国医大盛京医院2008年6月～2009年12月妇产科住院患者进入本研究。45例宫颈癌(Ⅰ-Ⅲ期)患者,年龄从30岁到70岁,平均年龄48岁。32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(Ⅰ-Ⅱ),年龄从30岁到60岁,平均年龄42岁。14例正常宫颈患者,年龄从30岁到62岁,平均年龄45岁。取材前均未接受任何治疗。宫颈组织诊断在盛京医院病理科。
2、免疫组织化学法
分别检测IFN-β和SHP-2蛋白在上述三组患者宫颈组织中的表达情况。
3、导流杂交法检测HPV16/18
检测HPV在上述三组患者宫颈组织中的表达情况。
4、Real-timePCR法
检测SHP-2的基因在上述三组患者宫颈组织中的表达情况。
二、SHP-2和IFN-B在宫颈病变患者血液中的表达情况
1、样本选择
选择中国医大盛京医院2008年6月～2009年12月妇产科住院患者进入本研究。45例宫颈癌(Ⅰ-Ⅲ期)患者,年龄从30岁到70岁,平均年龄48岁。32例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(Ⅰ-Ⅱ),年龄从30岁到60岁,平均年龄42岁。14例正常宫颈患者,年龄从30岁到62岁,平均年龄45岁。取材前均未接受任何治疗。宫颈组织诊断在盛京医院病理科。
2、Ficoll分层液分离人外周血单个核细胞
取上述三组患者新鲜抗凝血,用Ficoll分层液分离出人外周血单个核细胞。
3、Westernblot方法
检测上述三组患者人外周血单个核细胞中SHP-2蛋白的表达情况。
4、酶联免疫吸附实验
检测上述三组患者人外周血IFN-B的表达情况。
三、SiRNA沉默THP-1细胞中SHP-2的表达后负调控IFN-B的产生
1、细胞培养
SiHa细胞培养于含10%FBS的完全EMEM培养液(formulatedEaglesMinimumEssentialMedium)。
THP-1细胞培养于含10%热灭活的FBS和0.05mM的(2-mercaptoethanol)的RPMI1640培养液。
上述两个细胞共培养。
2、干扰SHP-2基因的表达
SHP-2siRNA干扰片段瞬时转染THP-1细胞,干扰SHP-2基因的表达。
3、SHP-2封闭肽(blockingpeptide)封闭实验
将SHP-2封闭肽以不同浓度(0、0.5、2.5ug/m1)和时间(2h和24h),作用于THP-1细胞,进行WesternBlotting实验,检测SHP-2的表达,确定封闭的最佳时间和浓度。
4、WesternBlotting法检测THP-1细胞中SHP-2蛋白表达情况
分别收集正常的THP-1细胞和不同处理因素的THP-1细胞,WesternBlotting法检测THP-1细胞中SHP-2蛋白表达。
5、MTT实验
将THP-1细胞及不同处理因素处理好的THP-1细胞分别与SiHa细胞共培养后,在选定的时间和浓度点测其OD值。
6、测细胞培养上清IFN-B的酶联免疫吸附实验(ELISA)
分别收集培养THP-1细胞的培养上清、给予SHP-2封闭肽作用的THP-1细胞培养上清和给予SHP-2siRNA干扰的THP-1细胞的培养上清,进行ELISA实验。
结果：
一、SHP-2和IFN-B在宫颈病变组织中的表达及其与HPV感染的关系
1、SHP-2在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织中的表达结果。
SHP-2在子宫颈癌组织中高表达。SHP-2的表达在宫颈癌及正常宫颈之间有显著性差异,有统计学意义(X2=13.17,P＜0.05)。SHP-2的表达在宫颈癌和CIN之间有显著性差异,有统计学意义(X2=7.57,P＜0.05)。虽然SHP-2在CIN中表达率高于正常宫颈,差异无统计学意义(X2=1.52,P＞0.05)。
2、IFN-B在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织中的表达结果。
IFN-β表达在宫颈癌及正常宫颈之间有显著性差异,有统计学意义(X2=6.61,P＜0.05)。IFN-β的表达在宫颈癌和CIN之间有显著性差异,有统计学意义(X2=7.69,P＜0.05)。虽然IFN-β在正常宫颈的表达率比在CIN高,但差异无统计学意义(X2=0.36,P＞0.05)。
3、SHP-2的mRNA在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织中的表达结果。
SHP-2的mRNA在宫颈癌组织的表达高于正常宫颈组织,有显著性差异,有统计学意义(q=4.177,p＜0.05)。SHP-2在癌组织中的表达高于CIN组织,有显著性差异,有统计学意义(q=3.624,P＜0.05)。
4、HPV16/18在宫颈癌、CIN、正常宫颈组织中的表达结果。
HPV16/18在正常宫颈的感染率是14.3%,在CIN的感染率是68.7%,在子宫颈癌的感染率是84.4%。
5、HPV16/18感染和SHP-2在不同宫颈组织中的表达的相关性分析。采用Spearman相关分析,分析了HPV感染的宫颈癌中SHP-2表达和无HPV感染的正常宫颈之间的相关性,结果证实HPV感染和SHP.-2在宫颈癌组织中的表达有相关性(rs=0.582,P＜0.05)。二、SHP-2和IFN.B在宫颈病变患者血液中的表达情况1、分离人外周血单个核细胞的结果离心后离心管中由上至下细胞分为四层。第一层:为血浆或组织匀浆层。第二层:为环状乳白色单个核细胞层。第三层:为透明分离液层。第四层:为红细胞层(此层表面有悬起的部分白细胞侧层收集届面上的细胞)。收集第二层细胞。
2、SHP-2蛋白在宫颈癌、CIN、正常宫颈患者外周血的表达结果。
由westernblot影像可以看出正常宫颈患者蛋白的条带显影非常浅,CIN患者蛋白的条带显影稍浅,而宫颈癌患者蛋白的条带显影非常深。
3、IFN-B在宫颈癌、CIN、正常宫颈患者外周血的表达结果。
宫颈癌组与正常宫颈组间有显著差异,差异有统计学意义(q=5.696,p＜0.05);宫颈癌组与CIN组间有显著差异,差异有统计学意义(q=5.465,p＜0.05);CIN组与正常宫颈组间无显著差异,差异无统计学意义(q=0.632,p＞0.05)。
三、SiRNA沉默THP-1细胞中SHP-2的表达后负调控IFN-B的产生
1、给予SHP-2的SiRNA后SHP-2蛋白的表达情况。
给予SHP-2的SiRNA后SHP-2蛋白表达明显降低,在干扰后48h、200pmol时干扰效果最好。
2、给予SHP-2的封闭抗体后SHP-2蛋白的表达情况。
给予SHP-2的封闭抗体后SHP-2蛋白表达明显降低,在封闭后24h、2.5ug/ml时抑制效果最好。
3、MTT实验的结果。
(1)THP-1细胞与SiHa细胞相互作用。
更换新的THP-1细胞培养液的0D值明显高于不换培养液的0D值,其差异有统计学意义。从两个细胞作用时间来看,THP-1细胞对SiHa细胞杀伤作用随着时间的增长而增强,从24小时起就起明显作用。
(2)SiRNA干扰和封闭肽作用的THP-1细胞与SiHa细胞作用。
给予siRNA干扰的THP-1细胞对SiHa细胞的杀伤作用最强(oD值最低),给予封闭肽的次之,无处理因素的最弱(0D值最高)。
4、酶联免疫吸附实验测IFN-B的结果。
SiRNA干扰组的浓度值最高,其次是封闭肽组的浓度值,无处理因素组(仅培养THP-1的细胞组)的浓度值最低(如图7所示)。SiRNA干扰组与无处理因素组之间有显著差异,差异有统计学意义(q=3.981,P＜0.05)。封闭肽组与无处理因素组之间有差异,差异有统计学意义(q=3.333,P＜0.05)。SiRNA干扰组与封闭肽组之间有差异,差异无统计学意义(q=0.648,P＞0.05)。
结论：
1、SHP-2在宫颈癌患者组织及血液中高表达。
2、IFN-β在宫颈癌患者组织及血液中低表达。
3、HPV感染与宫颈癌发生有关,在宫颈癌组织中HPV感染与SHP-2的表达存在相关性。
4、抑制THP-1细胞中SHP-2的表达后,THP-1细胞分泌的IFN-B明显增多,导致它对SiHa细胞的杀伤作用明显增强。
5、SHP-2在宫颈癌的发生中起着重要作用。它发挥作用的机制是通过抑制IFN-β的信号转导,减少Ⅰ型干扰素IFN-β的生成,使宫颈癌发生成为可能。