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钙调神经磷酸酶（CaN）是迄今发现的唯一受Ca2+／钙调素（CaM）调节的丝氨酸／苏氨酸的蛋白磷酸酶，它广泛分布在脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞等组织细胞中，通过对底物去磷酸化参与细胞功能的调节。CaN可由Ca2+介导的外部信号及细胞内的氧化还原电位共同调节。为了进一步研究CaN的作用，我们拟在不同组织中、氧化还原和脑缺血及预处理情况下，观察CaN的活性变化特点，并对其原因作进一步探究。研究目的第一部分：测定不同组织中CaN活性及其钙依赖性，观察不同组织中CaN的分布和钙依赖性特点。第二部分：观察脑缺血及脑缺血预处理动物的脑梗死体积变化和CaN活性变化，来评价缺血预处理对缺血脑组织的保护作用。第三部分：观察氧化和抗氧化作用对CaN活性的影响，以了解缺血和缺血预处理在氧化还原方面保护CaN活性的可能机制。实验方法第一部分：提取不同组织的CaN，测定蛋白浓度，应用紫外分光光度法测定CaN活性；配置浓度不同的CaCl2溶液，加入反应体系使其CaCl2总浓度为0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00mM，测定CaN活性。第二部分：1大鼠用水合氯醛腹腔麻醉固定后，应用Pulsinelli四血管阻断法制备大鼠全脑缺血和预缺血模型。2TTC方法染色，观察BRI的情况。3提取CaN，测定蛋白浓度，根据CaN测定反应体系的要求，加入相应的反应物和离子，应用紫外分光光度法测定CaN活性，反应温度为30℃，检测波长为405nm，检测间隔为30s，时间为5min。第三部分：取大鼠骨骼肌组织，提取CaN组织液，分六组（n＝15）做不同氧化和抗氧化处理，空白组不加任何处理，对照组加黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶，其余四组：除加入同等剂量黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶外，各组分别加入超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、甘露醇、二硫苏糖醇（DTT），提取骨骼肌CaN，测定蛋白浓度，向各组加入相应的处理因素，应用紫外分光光度法测定CaN活性，观察变化。实验结果第一部分：1不同组织CaN活性比较应用紫外分光光度法测定CaN活力（nmol／min／mg protein），结果为脑组织活力为6.81±2.41，与其它组比较活力最高（P＜0.01），其次为骨骼肌组织2.08±1.65，心肌组织为1.75±0.76，肝脏组织最低0.38±0.20。2 CaN钙依赖性应用紫外分光光度法测定不同组织中的CaN的钙依赖性，发现所得不同Ca2+浓度下CaN的活性变化在各组织中有共同点。随着Ca2+浓度不断增加，CaN活性逐渐被激活，当pCa(游离Ca2+浓度的负对数)超过4.52时，相当于总钙浓度为1mM，CaN活性达到最高，而随着pCa的继续上升，CaN活性又逐渐被抑制，即不同组织中CaN活性都表现为随Ca2+浓度改变而呈钟形曲线变化。第二部分：1对照组与实验组脑组织梗死体积比较对照组与实验组的脑组织在再灌注后，用TFC染色的方法检测梗死体积的变化，对照组与实验组的脑组织均出现了梗死区，对照组的梗死体积的百分比更大（14.83±4.37％），实验组的梗死体积百分比在（5.82±2.98％）的范围之内，P＜0.01，有统计学意义。2对照组与实验组脑组织CaN活性比较在缺血预处理的条件下，CaN活性（nmol／min／mg protein）实验组5.31±1.68高于对照组3.19±1.26，具有统计学意义（P＜0.05）。第三部分：1黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶所产生的氧自由基（OFR）对CaN活性的抑制作用与空白组CaN活性（nmol／min／mg protein）2.63±0.41比较，对照组1.76±0.59明显下降（P＜0.01），黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶系统产生的OFR使CaN活性下降33.1％。2各种抗氧化剂对CaN活性的保护作用与对照组相比，SOD组、CAT组、DTT组CaN活性（nmol／min／mg protein）明显增高，SOD组与对照组2.05±0.38 vs．1.76±0.59，P＜0.05，CAT组与对照组2.40±0.48 vs．1.76±0.59，P＜0.01，DTT组与对照组2.22±0.40 vs．1.76±0.59，P＜0.01，各组分别恢复到原活性的77.9％、91.3％、84.4％，具有明显的保护作用；而甘露醇与对照组1.78±0.62 vs．1.76±0.59，P＞0.05未发现有保护作用。结论1 CaN在大鼠体内各器官组织有广泛分布，可能参与多种器官组织的功能调节；钙依赖性实验结果表明大鼠不同器官组织中CaN对钙依赖性有共性，高钙引起的CaN活性抑制可能与CaN的内源性抑制物质有关。2大鼠BIP可以明显减少缺血再灌注损伤后的脑组织的梗死体积，降低脑组织的损伤程度，起到保护脑组织的作用。3通过对氧化还原反应的研究证实了SOD、CAT、DTT对CaN均有保护作用，而甘露醇效果不明显。抗氧化剂的保护机制则是减少OFR的释放及其破坏作用。4本研究结果对缺血预处理保护缺血脑组织的作用进行了证实，并且对其保护脑组织的机制有了进一步的了解，为BRI的防治提供了一定的理论指导和思路。