目的:应用免疫组化方法;RNA反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增相结合技术( RT-PCR )的方法,研究皮瓣组织缺血再灌注时相关凋亡基因Bax表达的变化规律;应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术(TUNEL)的方法检测皮瓣组织细胞的凋亡情况及其变化规律,探讨两者之间的相关性。进而揭示相关凋亡基因Bax在皮瓣损伤时与细胞凋亡的关系和变化规律,从而为皮瓣组织缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion IR)探索一条新的保护途径。方法:1.实验动物:雄性健康Wister大鼠50只,称重,编号。2.皮瓣制作方法:3﹪戊巴比妥钠(0.1～0.13ml/100mg)腹腔注射麻醉,每小时追加麻醉一次,每次0.05ml以维持麻醉。大鼠仰卧,四肢固定,剪除腹毛,75%酒精消毒,按照Petry JJ等描述的方法,于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣,大小约3㎝×6㎝。3.试验动物分组:将大鼠随机分为两组,(1)对照组25只:皮瓣形成后原位缝合,不做其它处理。时间点的选取以形成皮瓣后9、10、15、21、33小时分为5组与实验组形成对照,每组五只大鼠。(2)缺血再灌注组,即IR组25只:皮瓣形成后,用5-0丝线结扎腹壁浅动脉发出点远端的股动脉,用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉,皮瓣原位缝合。8小时后再次手术去除动脉夹恢复血供。按去除动脉夹血管再灌注后0、1、6、12、24小时分为5个组,每组五只大鼠。4、取材:对照组和试验组均分别按照时间点于皮瓣中段边缘取全层皮瓣组织1㎝×0.5㎝。所取组织中部分用多聚甲醛及时固定待做石蜡切片及免疫组化染色,以备细胞凋亡和Bax的检测。部分液氮冰冻后,置-80度冰箱中保存,以备RT-PCR检测。5、观测指标:(1)依照试剂盒说明书步骤和方法,以平均阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。(2)Bax基因的蛋白表达检测:切片脱蜡入水后阻断内源性POD,修复抗原,以S-P免疫组化法检测蛋白表达, DAB显色,胞膜或胞浆中有棕褐色颗粒者为Bax蛋白阳性,结果以Bax蛋白阳性表达指数(HIS)表示。切片分别于光镜400倍和100倍下放大,采用计算机图像分析系统:经图像分析仪随机选择5个视野,检测阳性细胞数(以A表示)分级0~1%=0、1~10%=1、10~50%=2、50~80%=3、80~100%=4 ;检测阳性细胞显色强度(以B表示)分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)HIS= A×B。(3)Bax mRNA表达检测,提取总RNA后采用逆转录多聚酶链反应,PCR产物电泳和半定量分析,取RT-PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳,用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果,用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。Bax的mRNA的相对含量用β-actin条带灰度值标化后的Bax条带灰度值表示。6、统计学处理:所有的试验数据以均数±标准差(X±S)表示,采用SPSS11.5软件进行检验,显著性分析以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.TUNEL细胞的观测结果:本实验观测到,在光镜下观察免疫组化切片时我们发现,在正常大鼠皮瓣组织中,即掀起皮瓣即刻的标本中,TUNEL细胞偶零星可见,凋亡细胞主要位于皮肤表皮层。随着缺血和再灌注时间的延长,TUNEL细胞数量急剧增多,实验组再灌注后随着时间延长,细胞凋亡速率逐渐降低,但其蛋白表达呈现增高的趋势。对照组蛋白表达亦呈增高趋势,但较实验组蛋白表达低。本实验未观测到恢复至正常的时间段。并且各时间段对照组和实验组比较均有统计学意义(P<0.05)。由此推断,细胞凋亡是皮瓣组织缺血再灌注损伤因素的重要因素之一。2.Bax蛋白的表达:本实验观测到,实验组随着缺血和再灌注时间的延长,Bax蛋白表达急剧增多,至再灌注后6小时达到高峰。此后开始缓慢下降,本实验尚未观测到恢复正常时间的时间段。对照组Bax蛋白表达在各时间段呈下降趋势,本实验未观测到恢复至正常时的时间段。两组中各时间段经SPSS统计学检验均有统计学意义(P<0.05),并且观测到Bax变化趋势和TUNEL细胞的变化呈现相关性。由此可以推断:细胞凋亡相关基因Bax在皮瓣组织中起着相关调控作用。3.Bax mRNA的表达:本实验观测到,皮瓣组织中Bax基因的mRNA经过RT-PCR扩增后,得到特异性的DNA片段,长度为407bp。在皮瓣缺血再灌注损伤后,Bax的变化随着缺血再灌注时间的延长,该基因转录本表达水平逐渐增高,至再灌注后6小时达到高峰,后逐渐降低,恢复至正常时间本实验尚未得出。对照组Bax基因mRNA呈下降趋势,本实验未观测到其恢复至正常时的时间段。其变化基本与Bax蛋白在皮肤组织中的表达水平基本一致。由此可以进一步推断出:细胞凋亡相关基因Bax在皮瓣组织细胞凋亡过程中起着相关调控作用。结论:本实验通过观察皮瓣组织在发生缺血再灌注损伤时的细胞凋亡情况和凋亡相关基因Bax的变化规律,得出以下几点结论:1、皮瓣组织缺血再灌注时,细胞凋亡是其损伤的重要因素之一。并且随着时间的推移血流的恢复和损害因素的减少,细胞凋亡速率逐渐降低。2、通过免疫组化法和RT-PCR的实验方法检测细胞凋亡基因Bax的蛋白表达和其mRNA转录本的表达结果显示:Bax随着皮瓣组织的缺血和再灌注损伤的发生,其表达显著增多,至再灌注后6小时达到高峰,后逐渐下降,但未发现恢复至正常时的时间段。这两个结论表明:在皮瓣组织中,细胞凋亡相关基因Bax在细胞凋亡过程中起相关调控作用,从而为防治皮瓣组织发生I/R损伤的临床实践提供相关依据,为皮瓣组织I/R后组织损伤的保护和预防探讨一条新途径。